基于HLA-B-2705α1α2結(jié)構(gòu)域拮抗肽的強直性脊柱炎治療性疫苗篩選及動物模型建立.pdf

1、背景:強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是嚴重危害人類健康,最終導(dǎo)致殘疾或完全喪失勞動力的慢性全身性自身免疫性疾病。AS在我國的發(fā)病率為0.2％-0.6%,患者400萬左右,男女比例為5-10:1,好發(fā)于青壯年。AS的病因不清,病機不詳,但是HLA-B27與AS的相關(guān)性最大。AS是HLA-B27分子誘發(fā)的多種因素所導(dǎo)致成骨組織發(fā)生的自身免疫性反應(yīng)。目前所用藥物與方案主要為非特異性的傳統(tǒng)藥物或和生物類藥物,

2、在具有一定療效的同時,其毒副作用嚴重。因此,深入探究AS的發(fā)病機制、研發(fā)特異性治療藥物就顯得尤為重要和迫切。
　　研究資料表明,HLA-B27與AS的發(fā)生最為相關(guān),是其免疫病理反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵分子;而且,HLA-B*2705為B27等位基因的祖先基因,其他等位基因都是從它的基礎(chǔ)上進化而來。HLA-B*2705等位基因頻率在中國漢族B27陽性AS患者中為41.1%,是AS發(fā)病的關(guān)鍵分子之一。此外,HLA-B27分子的α1α2結(jié)構(gòu)域是其

3、與抗原肽結(jié)合的關(guān)鍵位置,因此,我們選擇HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域作為靶標來篩選能特異性阻斷HLA-B*2705免疫致病機理的拮抗肽(antagonist peptide,AP)。鑒于此,本研究建立了基于HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域拮抗肽的強直性脊柱炎治療性疫苗及其轉(zhuǎn)基因動物模型,為HLA-B27拮抗肽治療性基因疫苗在強直性脊柱炎模型中的療效觀察和治療機理研究提供實驗基礎(chǔ)和動物模型支持。
　　目的:1.建立基于HLA-

4、B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域拮抗肽的新型治療性DNA疫苗,并體外觀察其特異性封閉B27分子以阻斷其與特異性抗體結(jié)合的功能。
　　2.建立HLA-B*2705強制性脊柱炎轉(zhuǎn)基因小鼠模型,為闡述基于拮抗肽的新型治療性DNA疫苗逆轉(zhuǎn)AS病理性免疫狀態(tài)的作用機制,探索其治療強直性脊柱炎的可行性,提供源源不斷的樣本保障。
　　方法:1、設(shè)計合適引物,提取HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域編碼基因,并構(gòu)建含HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)

5、域編碼基因的PET-32a原核表達載體,將載體轉(zhuǎn)化進入 TOP10感受態(tài)細胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達和His-Tag融合蛋白層析純化后,收集蛋白,采用補體依賴性淋巴毒實驗,對α1α2結(jié)構(gòu)域蛋白的活性進行鑒定。
　　2、收集純化后的α1α2結(jié)構(gòu)域蛋白,采用噬菌體展示肽庫(Phage display peptide library)技術(shù)進行拮抗肽的篩選,經(jīng)過3輪淘洗,富集陽性噬菌體,在涂有IPTG和X-Gal平板上挑取20個藍色菌斑擴增

6、培養(yǎng)并進行ELISE檢測,同時提取噬菌體DNA,進行測序;選取OD值大,而且通過測序重復(fù)序列多的作為所需要的序列;根據(jù)拮抗肽序列設(shè)計4條長引物,構(gòu)建含拮抗肽序列的pcDNA3.1-AP和pcDNA3.1-EGFP-AP真核表達載體,采用GenFectin介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染到COS7細胞中進行蛋白表達,熒光顯微鏡下觀察含pcDNA3.1-EGFP-AP的COS7細胞,以確定拮抗肽能否表達;根據(jù)拮抗肽序列,由體外合成所需要的拮抗肽,將表達肽段與合

7、成肽段同時進行B27抗體與B27陽性細胞結(jié)合的阻斷實驗,通過流式觀察結(jié)果,來確定拮抗肽的阻斷效果。
　　3、從美國Taconic Transgenic Exchange TM公司購入mβ2m-/-基因缺陷性C57小鼠;提取HLA-B*2705全長基因和hβ2m基因,交由華大基因公司進行轉(zhuǎn)基因C57小鼠模型的制備;將制備成功的HLA-B*2705+hβ2m+轉(zhuǎn)基因小鼠模型和mβ2m-/-的小鼠模型通過雜交、回交等方式進行交配,提取小

8、鼠的DNA和RNA進行檢測,最終篩選出純合HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m-/-小鼠模型。
　　結(jié)果:1、成功構(gòu)建含HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域編碼基因的PET-32a原核表達載體;經(jīng)轉(zhuǎn)化進入TOP10感受態(tài)細胞中,α1α2結(jié)構(gòu)域成功地以可溶性形式表達;經(jīng)層析純化后,得到純化后的蛋白分子。經(jīng)補體依賴性淋巴毒實驗,最終獲得具有生物活性的α1α2結(jié)構(gòu)域分子。
　　2、利用噬菌體展示肽庫技術(shù),經(jīng)過3輪淘洗成功篩選出與

9、HLA-B*2705分子高度親和的拮抗肽,序列為X1(OD值:1.5,因具有商業(yè)價值故序列保密)。成功構(gòu)建含拮抗肽序列X1的pcDNA3.1-X1和pcDNA3.1-EGFP-X1真核表達載體。pcDNA3.1-EGFP-X1真核表達載體經(jīng)轉(zhuǎn)染COS7細胞,可觀察到綠色熒光蛋白表明拮抗肽可高效表達。體外拮抗肽阻斷實驗結(jié)果表明,拮抗肽可以成功阻斷B27抗體與B27陽性細胞的結(jié)合,并與體外合成的肽段相比,細胞合成的拮抗肽的阻斷效果更好。

10、r>　　3、成功提取HLA-B*2705和hβ2m基因,并成功建立含HLA-B*2705+hβ2m+轉(zhuǎn)基因C57小鼠。通過與mβ2m-轉(zhuǎn)基因C57小鼠交配,在F1代得到HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m+/-小鼠模型。對F2代采用雜交和回交的方式進行交配,成功篩選出純合HLA-B*2705+hβ2m+mβ2m-/-小鼠模型。
　　結(jié)論:通過以上研究,本研究首先成功表達出HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域的可溶性蛋白分子,為進

11、一步通過噬菌體篩選技術(shù)篩選拮抗肽提供了可溶性蛋白保障。其次,本研究成功構(gòu)建了基于HLA-B*2705α1α2結(jié)構(gòu)域拮抗肽的強直性脊柱炎治療性疫苗。本研究成功篩選出HLA-B*2705特異性拮抗肽,并構(gòu)建了pcDNA3.1-B*2705-AP以及pcDNA3.1-B*2705-EGFP-AP真核表達載體,證明拮抗肽可在COS7細胞中表達。體外實驗證實拮抗肽能夠阻斷HLA-B27單抗與HLA-B27陽性細胞的結(jié)合,并同時證實細胞表達拮抗肽比