建立成人腎臟條件永生化足細(xì)胞株的初步研究.pdf

1、糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者致死、致殘的主要原因之一。其臨床特點(diǎn)為尿蛋白排泄率逐年增加、腎功能逐漸減退至終術(shù)期腎病。既往研究認(rèn)為,DN的主要病理特征是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)堆積、系膜細(xì)胞增多、基底膜增厚,腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。然而,腎活檢示伴大量蛋白尿的1型和2型糖尿病患者均有腎小球足細(xì)胞密度和數(shù)量減少、剩余足細(xì)胞胞體及核體積增大、足突增寬等改變,而且

2、尿白蛋白排泄率與足細(xì)胞密度呈反相關(guān),正常蛋白尿或伴微量白蛋白尿的患者足細(xì)胞數(shù)量正常。另外,與系膜細(xì)胞不同,足細(xì)胞是一種高度分化細(xì)胞,分裂增殖能力有限,一旦損傷丟失,很難再生。因此,足細(xì)胞損傷在糖尿病腎病中的作用逐漸上升,越來越多的學(xué)者致力于足細(xì)胞的體內(nèi)、體外研究。
　　 現(xiàn)行主要的足細(xì)胞體外培養(yǎng)方法基于Krakower和Greenspon的基礎(chǔ)研究和Burlington和Cronkite的改良。簡要的說,是在無菌條件下,通過一系

3、列不銹鋼篩網(wǎng)的篩查(篩分法),篩網(wǎng)篩孔由250um到150um,最終在75um的篩網(wǎng)上收集得到大鼠腎小球。后經(jīng)過一些學(xué)者的逐步改進(jìn),人和嚙齒類腎臟足細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)基本成熟,還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時出現(xiàn)的兩種形態(tài)細(xì)胞——鵝卵石樣細(xì)胞和樹枝狀分叉細(xì)胞是同一種細(xì)胞,兩者只是分化程度的差別,且前者可向后者轉(zhuǎn)化。
　　 足細(xì)胞是一種高度分化細(xì)胞,體外培養(yǎng)出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,很難長期培養(yǎng),收集到細(xì)胞數(shù)量也有限。為此,Mundel和Jat等發(fā)展了轉(zhuǎn)基因小

4、鼠,來提取永生化足細(xì)胞株,細(xì)胞在10％培養(yǎng)基33℃培養(yǎng),并添加INF-γ使其終濃度為100U/ml(許可條件),此時細(xì)胞具有無限增殖能力;當(dāng)移至37℃培養(yǎng),培養(yǎng)基中不含INF-γ(非許可條件)時細(xì)胞6-14天之內(nèi)生長停滯并分化。這個細(xì)胞株的建立使小鼠足細(xì)胞的研究取得了爆炸性進(jìn)展。
　　 人類永生化足細(xì)胞株的構(gòu)建相較于嚙齒類動物就落后很多,只有Delarue等建立的有限永生化足細(xì)胞株和Saleem等建立的條件永生化足細(xì)胞株。雖然證

5、明在許可條件下細(xì)胞具有50代以上的增殖活性,非許可條件下可分化并表達(dá)足細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白,但是這兩種細(xì)胞株都來源于嬰兒或兒章腎臟,與成人的成熟足細(xì)胞表型存在差異,不能較好的代表腎臟的生理學(xué)和病理學(xué)狀態(tài),而且這兩種細(xì)胞株成本高,很難重復(fù),無法廣泛使用。
　　 基于國內(nèi)足細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)展緩慢,人腎臟永生化足細(xì)胞株空白的現(xiàn)狀,本研究充分考察國際上足細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,進(jìn)行成人腎臟條件永生化足細(xì)胞株的初步研究,為建立細(xì)胞株做好充分準(zhǔn)

6、備,進(jìn)一步為人腎臟足細(xì)胞的體外研究提供一個簡便可行的平臺,并為糖尿病腎病的治療尋找新的可行方法。
　　 第一章:成人腎臟足細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定目的:建立一種重復(fù)性好、操作簡便的成人腎臟足細(xì)胞原代培養(yǎng)方法.方法:腎臟單極腫瘤患者行腎切除術(shù)時,取切除組織的正常腎皮質(zhì),通過差異
　　 篩選法分別通過80、40、120目細(xì)胞篩網(wǎng),收集120目篩網(wǎng)上腎小球進(jìn)行接種,利用植塊法將接種培養(yǎng)面向上放置,4h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來添加培養(yǎng)基正

7、常放置于37℃、5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育。采用形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞間接免疫熒光染色法,對足細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并用流式細(xì)胞儀分析足細(xì)胞純度。
　　 結(jié)果:3d后可見絕大部分腎小球貼壁,5d后幾乎全部腎小球貼壁,少許腎小球周圍有細(xì)胞爬出,7～8d可見所有腎小球周圍大量細(xì)胞爬出,胰蛋白酶差異消化后傳代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)出的細(xì)胞形態(tài)學(xué)符合足細(xì)胞特征,足細(xì)胞特異性蛋白WT-1、nephrin陽性,內(nèi)皮細(xì)胞特異因子F8蛋白陰性。流式細(xì)胞儀分析

8、足細(xì)胞純度大于98%。
　　 結(jié)論:差異過篩法分離人腎小球,結(jié)合植塊法促進(jìn)腎小球貼壁,可簡單、高效地培養(yǎng)出原代足細(xì)胞,具備足細(xì)胞生物學(xué)特征,且在操作簡單的情況下細(xì)胞產(chǎn)量、純度與國外文獻(xiàn)報道相當(dāng)。
　　 第二章:溫度敏感Sv40大T抗原逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的建立
　　 目的:構(gòu)建溫度敏感SV40大T抗原逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-tsA58和包裝細(xì)胞株,并研究其在包裝細(xì)胞PA317中的表達(dá)。
　　 方法:從首都

9、醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)系獲贈重組溫度敏感逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pLXSN-tsA58,其構(gòu)建方法是將pBR3222-SV40 tsA58經(jīng)KpnⅠ酶切后,再用BamHⅠ和NcoⅠ酶切,回收目的片段進(jìn)行末端補(bǔ)平。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN經(jīng)EcoRI酶切并對線性化載體進(jìn)行脫磷酸化處理后,與SV40 tsA58目的片段連接。我們轉(zhuǎn)化擴(kuò)增pLXSN-tsA58,酶切鑒定,測序證實(shí)。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)pLXSN-tsA58轉(zhuǎn)染入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317

10、中,經(jīng)G418篩選后,挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng),收集病毒上清液,并用NIH3T3細(xì)胞測定病毒滴度,獲得高滴度的抗性克隆,命名為PA317/tsA58。
　　 結(jié)果:將pLXSN-tsA58轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后酶切鑒定出現(xiàn)與預(yù)期相符的5個片段,進(jìn)一步測序證實(shí)SV40tsA58基因存在,且擴(kuò)增得到高濃度質(zhì)粒。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后篩選出PA317/tsA58細(xì)胞抗性克隆,PCR鑒定SV40tsA58基因整合在克隆細(xì)胞基因組中,免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定克隆細(xì)胞SV40

11、tsA58蛋白表達(dá)。收集病毒上清液,滴度達(dá)105CFU/ml。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建溫度敏感SV40大T抗原逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-tsA58,建立的包裝細(xì)胞系PA317/tsA58能穩(wěn)定產(chǎn)生高滴度病毒顆粒,為下一步感染成人腎臟足細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過差異過篩法分離成人腎小球,結(jié)合植塊法促進(jìn)腎小球貼壁,簡單、高效地培養(yǎng)出原代足細(xì)胞。
　　 2.培養(yǎng)出的足細(xì)胞具備成人足細(xì)胞生物學(xué)特