HBV適應(yīng)性雜交細胞株的建立和初步研究.pdf

1、研究背景: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起嚴(yán)重肝臟疾病的病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球20多億人曾感染乙肝病毒，其中約3.5億人為慢性乙肝病毒感染者。慢性乙肝不易徹底治愈，并隨著病情發(fā)展可惡化成肝硬化、肝癌。自1965年Blumberg等發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原，到1997年病毒全基因組的克隆和測序完成，人們對HBV的基因組成和抗原的結(jié)構(gòu)、生物特性及其生命周期的認(rèn)識迅速發(fā)展。但因缺乏體外增

2、殖系統(tǒng)和易獲得的細胞模型，HBV感染肝臟的早期機理研究進展較為緩慢，從而在一定程度上影響乙型肝炎及其相關(guān)肝臟疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。由于人的肝組織來源有限，而且HBV病毒粘附以及DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制對宿主有嚴(yán)格的限制，先前研究過的細胞模型又各存在其不可避免的缺陷。因此，建立一個近于自然感染狀態(tài)即既適用于轉(zhuǎn)染又可用血清中病毒顆粒直接感染，接近肝細胞生理狀態(tài)并能穩(wěn)定表達HBV抗原的細胞模型是急需的。 本研究旨在通過將利用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)產(chǎn)生

3、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)基因突變的HepG2細胞與人原代肝細胞融合，建立雜交細胞株，這個雜交細胞株從細胞基因工程學(xué)理論上講應(yīng)該具有雙親遺傳學(xué)特性，即既具有人原代肝細胞對HBV易感的特性又具有HepG2細胞能體外長期傳代的特性。并對HBV在該雜交細胞的感染情況進行初步研究。 目的: 建立不同于HepG2細胞及人原代肝細胞的新型雜交細胞株，使該細胞株既能長期攜帶HBV又能體外傳代培養(yǎng)。 方法:

4、 誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生HGPRT基因突變，將篩選出的HGPRT缺陷的HepG2細胞與攜帶HBV的人原代肝細胞進行融合得雜交細胞，用HAT培養(yǎng)基篩選出異核體雜交細胞，再利用有限稀釋法進行克隆，通過核型分析方法鑒定所得細胞。對所得雜交細胞及培養(yǎng)上清液進行HBV DNA和HBsAg、HBeAg的檢測。實驗同時，用未雜交的HepG2細胞和人原代肝細胞作對照。 結(jié)果: 經(jīng)篩選后，有一雜交細胞株(HepCHLine3)克隆成功。

5、HepCHLine3在形態(tài)學(xué)上與HGPRT缺陷HepG2細胞相似，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示HepCHLine3雜交細胞染色體眾數(shù)為99條，證明為融合細胞株，含所有來自HepG2細胞和人原代肝細胞的基因數(shù)。傳代培養(yǎng)的HepCHLine3及其培養(yǎng)上清液用巢式PCR可分別檢測到HBV DNA，培養(yǎng)上清液內(nèi)檢測到HBsAg和HBeAg。對照組的HepG2細胞和人原代肝細胞相應(yīng)結(jié)果為陰性。結(jié)果提示該細胞攜帶并分泌HBV DNA。