宮頸癌放射抗拒細胞株的建立及其抗拒機制的初步研究.pdf

1、背景
　　宮頸癌是全球女性的第三位常見惡性腫瘤。放射治療作為其主要的治療手段,在臨床治療中取得了良好效果,但仍然存在失敗的案例,其主要原因為腫瘤盆腔內(nèi)復發(fā)。目前,放療后復發(fā)癌治療普遍困難,平均5年生存率不超過20％。放療敏感性降低是放療后復發(fā)腫瘤的普遍特點。因此,探索宮頸癌復發(fā)后放療抗拒機制,提高放療敏感性對復發(fā)癌的治療具有重要意義。
　　近年來放射生物學研究認為:腫瘤細胞在放療后會產(chǎn)生放射抗拒的異質(zhì)細胞,這群細胞是產(chǎn)生抗拒

2、性的主要原因。目前,國內(nèi)外已有多種惡性腫瘤成功建立獲得性放射抗拒細胞株的報道,但建株方式多樣尚無公認的標準。因此,探索宮頸癌放射抗拒細胞株的建立模式十分必要。此外,建立的宮頸癌放射抗拒細胞株可為后續(xù)研究提供可靠的模型。
　　DNA雙鏈是放射線打擊的主要靶點,DNA損傷修復能力是影響腫瘤放射敏感性的重要因素。在證實了Hela-R細胞株的DNA損傷修復增強后,我們試圖利用DNA損傷修復相關基因的表達,解釋其DNA修復能力提升的原因和機

3、制。
　　基因的表達調(diào)控具有多種模式,其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控最為重要?；蛐酒夹g是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要方法,利用基因芯片可以觀察到多數(shù)已知基因的轉(zhuǎn)錄情況。繪制宮頸癌放射抗拒細胞株的基因轉(zhuǎn)錄差異譜,對研究宮頸癌放射抗拒機制可能具有重要指導意義。微小RNA(microRNA,miRNA)作為一類廣泛存在于真核生物中的非編碼單鏈小分子RNA,是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。多項研究已證實了miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的重要作用,但其在腫瘤放

4、射抗拒中的作用仍未闡明。因此,利用miRNA芯片繪制宮頸癌放射抗拒細胞株的miRNA表達差異譜,再結(jié)合基因芯片結(jié)果,將會為宮頸癌放療增敏提供新的理論依據(jù)與作用靶點。
　　目的
　　1、建立宮頸癌放射抗拒細胞株(Hela-R),為研究宮頸癌放射抗拒機制提供細胞模型
　　2、明確參與Hela-R細胞株放射抗拒的DNA損傷修復基因
　　3、繪制Hela-R細胞株的基因轉(zhuǎn)錄差異譜與miRNA表達差異譜
　　4、探索

5、miRNA調(diào)控Hela-R細胞株放射抗拒的作用機制
　　材料與方法
　　1、采用常規(guī)劑量分割法與亞致死劑量法分別建立宮頸癌獲得放射抗拒細胞株。采用克隆形成實驗分析不同亞組細胞的放射抗拒性。采用CCK-8法測細胞增殖能力,采用流式細胞儀測定細胞凋亡與細胞周期。
　　2、采用彗星實驗與Edu摻入實驗測定細胞DNA損傷修復能力。采用Westren-blot檢測DNA損傷應答相關基因(ATM與GADD45α)的表達情況。

6、>　　3、采用Affymetrix公司GenomeU219ArrayPlate繪制宮頸癌放射抗拒細胞株基因轉(zhuǎn)錄差異譜,采用Agilent公司miRNA芯片繪制miRNA表達差異譜。采用Targetscan與microRNA.org網(wǎng)站預測miRNA的靶基因。采用qRT-PCR實驗驗證基因芯片與miRNA芯片結(jié)果。利用Western-blot檢測miRNA-181amimic轉(zhuǎn)染后BAG4的表達情況。免疫組化檢測BAG4在宮頸癌組織中的表

7、達。
　　結(jié)果
　　1、采取常規(guī)分割法建立的亞細胞株的放射抗拒性均優(yōu)于亞致死劑量組,其中2Gy25次組具有最強的放射抗拒性(平均致死劑量D0=4.81Gy),我們將其命名為Hela-R細胞株。Hela-R細胞株受到6MV6GyX射線照射后24h,增殖速度快于親本細胞(Hela),早、晚期凋亡率均低于Hela細胞株。但在照射48h與72h后其增殖速度減慢,且細胞周期出現(xiàn)了顯著的G2期阻滯。
　　2、彗星實驗中采用相同劑量

8、的X線處理Hela與Hela-R細胞株,1h后兩者彗星尾長無差異。照射后12h、24h、48h,Hela-R細胞株的彗星尾長顯著短于Hela細胞株。5-乙基-2’-脫氧尿苷(EdU)摻入實驗中亦用相同X線處理以上兩種細胞。處理后1h,Hela-R細胞株的胞核內(nèi)摻入了更多的DNA修復原料類似物EdU。以上結(jié)果均表明Hela-R細胞株的DNA修復能力明顯強于Hela細胞株。
　　3、給予相同放射線處理后,Hela-R細胞株的ATM磷酸

9、化水平高于其親本細胞,說明其DNA損傷應答的強度與速度均優(yōu)于親本細胞。相同放射線處理前、后,Hela-R細胞株中G2期阻滯相關蛋白GADD45α的表達隨時間逐步上升,且同期均高于Hela細胞株。這提示GADD45α是致使Hela-R細胞株G2期阻滯的重要原因。
　　4、基因芯片與miRNA芯片結(jié)果提示:Hela-R與Hela細胞株之間存在9個差異表達的DNA損傷修復相關基因,其中7個miRNA表達增高,2個表達降低;9個抗凋亡基因

10、表達增高。Hela-R與Hela細胞株存在49個差異表達的miRNA,其中10個miRNA表達增高,39個表達降低。經(jīng)過生物信息學分析預測,qRT-PCR及Western-blot驗證發(fā)現(xiàn)在Hela-R細胞株中miRNA-181a的表達缺失通過、削弱了其對抗凋亡基因BAG4的表達調(diào)控作用,高表達上調(diào)的BAG4促使Hela-R細胞株產(chǎn)生放射抗拒性。
　　5、BAG4蛋白在宮頸癌組織中表達顯著高于正常宮頸組織。23例放療后殘存宮頸癌組

11、織中均可見BAG4蛋白的表達。
　　結(jié)論
　　1、采用常規(guī)分割法單次2Gy照射25次模式可建立穩(wěn)定的宮頸癌放射抗拒細胞株(Hela-R)。
　　2、Hela-R細胞株較親本細胞具有更突出的放射抗拒性、DNA損傷修復能力及放射后G2期阻滯與抗凋亡能力。
　　3、X線照射后ATM磷酸化水平增高與GADD45α表達上調(diào)是Hela-R細胞株DNA損傷修復能力增強與G2期阻滯的主要原因。
　　4、miRNA-181a