大豆高效整個(gè)子葉節(jié)再生體系的建立及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙價(jià)抗蟲基因在大豆上的轉(zhuǎn)化.pdf

1、大豆是世界上重要的油料作物以及植物蛋白來源之一，因此大豆基因工程育種具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)采用一種新的技術(shù)方法即大豆整個(gè)子葉節(jié)為外植體，利用直接芽再生方式建立了一種新的快速有效的再生體系，并在此平臺(tái)上用雙價(jià)抗蟲基因?qū)Υ蠖惯M(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。 成熟大豆種子消毒后在添加BA0.4mgL-1的MSB5培養(yǎng)基中培養(yǎng)了5～7d得到無菌苗，切取整個(gè)子葉節(jié)外植體，將外植體轉(zhuǎn)入不同芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后，轉(zhuǎn)入MSB5培養(yǎng)基上進(jìn)行芽伸長培養(yǎng)，至芽伸

2、長到3～4cm，轉(zhuǎn)至含有IBA0.5mgL-1的MSB5培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，煉苗并移栽到溫室得到可育植株。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)芽的形態(tài)發(fā)生過程以及細(xì)胞內(nèi)淀粉和蛋白質(zhì)含量的相對(duì)變化進(jìn)行了觀察分析，發(fā)現(xiàn)分生細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量隨著芽發(fā)育的不同階段呈周期性變化；研究了BA或CPPU對(duì)大豆整個(gè)子葉節(jié)芽誘導(dǎo)的作用，確定了BA在整個(gè)子葉節(jié)芽誘導(dǎo)過程中效果好于CPPU；利用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)三種植物激素以及大豆基因型對(duì)芽誘導(dǎo)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，BA、KT、IB

3、A對(duì)芽誘導(dǎo)效果都有極顯著影響，其中BA的影響最大，大豆品種合豐25在MSB5+BA3.0mgL-1+IBA0.2mgL-1+KT0.5mgL-1的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出芽效果最好，每個(gè)外植體可以得到30～35個(gè)芽，并且大部分芽都可以伸長并生根。為了驗(yàn)證新建立的再生體系的效果，將此再生體系與傳統(tǒng)的大豆子葉節(jié)再生體系、近幾年應(yīng)用較多的大豆胚尖再生體系在再生頻率、出芽數(shù)目、芽伸長情況以及再生周期等方面進(jìn)行研究比較，結(jié)果表明，大豆整個(gè)子葉節(jié)再生體系在外

4、植體再生頻率以及出芽數(shù)量上優(yōu)于其它兩種體系。 本實(shí)驗(yàn)嘗試采用大豆整個(gè)子葉節(jié)為外植體建立了一種快速有效的再生體系，與子葉節(jié)、胚尖再生體系相比較，提高了再生效率和不定芽的數(shù)量，減小了品種特異性對(duì)大豆再生體系的影響，并且大大縮短了再生周期。研究結(jié)果表明，使用這個(gè)再生平臺(tái)，再生效率達(dá)到95％以上，可以在60天內(nèi)獲得大量的再生小苗。 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法對(duì)三個(gè)大豆品種的整個(gè)子葉節(jié)外植體進(jìn)行雙價(jià)抗蟲基因的遺傳轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化體

5、系中幾個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了基于整個(gè)子葉節(jié)再生平臺(tái)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，不同農(nóng)桿菌菌株對(duì)大豆的轉(zhuǎn)化效率不同，EHA105的轉(zhuǎn)化效率高于LBA4404和GV3101；不同大豆品種對(duì)農(nóng)桿菌浸染的敏感性存在差異，其中合豐48的效果較好；轉(zhuǎn)化過程中采用Cef300mgL-1+Cb200mgL-1和PPT5.0mgL-1進(jìn)行除菌和篩選，效果較好。應(yīng)用這個(gè)轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化頻率在5.50％～12.07％之間。經(jīng)過分子驗(yàn)證以及抗除草劑、抗蚜蟲實(shí)驗(yàn)