線粒體脫乙?；窼irt3在D-半乳糖誘導(dǎo)的聽皮層早衰中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文分三個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化模型的建立
　　目的:建立D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化模型。
　　方法:2月齡Sprague Dawley(SD)雌性大鼠48只隨機(jī)分為兩組：其中D-半乳糖組給予D-半乳糖500mg/kg/d,頸背部皮下注射，連續(xù)8周；另一組為對(duì)照組（自然老化組），給予等體積生理鹽水，連續(xù)8周。造模結(jié)束后，每個(gè)組分為三個(gè)亞組：4月齡組（造模結(jié)束后0個(gè)月）、10月齡組（造模結(jié)束后6

2、個(gè)月）和18個(gè)月組（造模結(jié)束后14個(gè)月）。造模結(jié)束后，每只大鼠檢測(cè)聽性腦干反應(yīng)（ABR）；透射電鏡下觀察聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的退行性變化；甲苯胺藍(lán)染色觀察聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目變化；原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)聽皮層細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：10月齡和18月齡D-半乳糖組與自然老化組相比，32 kHz聽閾顯著提高（P<0.05）。透射電鏡觀察顯示，同齡的D-半乳糖組與自然老化組大鼠相比，細(xì)胞核變形、染色質(zhì)固縮、脂褐素沉積、線粒體

3、腫脹、神經(jīng)纖維脫髓鞘樣變等細(xì)胞衰老的超微結(jié)構(gòu)病理變化出現(xiàn)時(shí)間更早且退行性變更為顯著。神經(jīng)元染色顯示，D-半乳糖組大鼠聽皮層神經(jīng)元與同齡自然老化組相比密度降低，18月齡差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TUNEL檢測(cè)表明，D-半乳糖組大鼠聽皮層細(xì)胞凋亡數(shù)目與同年齡的自然老化大鼠相比，10和18月齡細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：隨著年齡的增長(zhǎng)，聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)退行性變明顯、神經(jīng)元密度下降、凋亡數(shù)目增多；D-

4、半乳糖加速了聽皮層細(xì)胞衰老的發(fā)展，促進(jìn)了老年性聾的發(fā)生。
　　第二部分：端粒、端粒酶與聽覺老化的相關(guān)性研究
　　目的：探討端粒、端粒酶與聽覺老化的相關(guān)性。
　　方法：2月齡SD雌性大鼠72只隨機(jī)分為兩組：D-半乳糖組給予D-半乳糖500mg/kg/d,頸背部皮下注射，連續(xù)8周；對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)8周。造模結(jié)束后，每個(gè)組分為三個(gè)亞組：4月齡組（造模結(jié)束后0個(gè)月）、10月齡組（造模結(jié)束后6個(gè)月）和18個(gè)月組（造

5、模結(jié)束后14個(gè)月）。通過分光光度計(jì)比色法檢測(cè)血清ROS水平；RT-PCR檢測(cè)聽皮層端粒長(zhǎng)度及端粒酶TERT mRNA的表達(dá)；western blotting檢測(cè)聽皮層端粒酶蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：自然老化組中，隨著年齡增長(zhǎng)，ROS水平增加；端粒長(zhǎng)度變短；端粒酶活性下降。與同齡的自然老化大鼠相比，D-半乳糖組中H2O2和MDA水平升高，而T-SOD活性降低；D-半乳糖組中大鼠聽皮層端粒長(zhǎng)度在18月齡時(shí)縮短有顯著差異（P<0.05）

6、；D-半乳糖組中大鼠聽皮層細(xì)胞4月齡、10月齡和18月齡TERT mRNA表達(dá)下降均有顯著變化（P<0.05）；D-半乳糖組中聽皮層端粒酶TERT在10月齡和18月齡蛋白表達(dá)下降有顯著差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：隨著年齡的增長(zhǎng)，端粒長(zhǎng)度變短、端粒酶表達(dá)減少。D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化模型加速端粒長(zhǎng)度的縮短及端粒酶活性的下降，即加速衰老。
　　第三部分：探討線粒體脫乙酰化酶Sirt3在D-半乳糖誘導(dǎo)的聽皮層早衰中的作用

7、>　　目的：探討Sirt3在D-半乳糖誘導(dǎo)的聽皮層功能障礙中的可能的作用機(jī)制。
　　方法：2月齡SD雌性大鼠144只隨機(jī)分為兩組：D-半乳糖組給予D-半乳糖500mg/kg/d,頸背部皮下注射，連續(xù)8周；對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)8周。造模結(jié)束后，每個(gè)組分為三個(gè)亞組：4月齡組（造模結(jié)束后0個(gè)月）、10月齡組（造模結(jié)束后6個(gè)月）和18個(gè)月組（造模結(jié)束后14個(gè)月）。分光光度計(jì)比色法檢測(cè)中樞聽皮層MDA含量和SOD2活性；Taqma

8、n探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)聽皮層mtDNA4834 bp的缺失率；RT-PCR檢測(cè)Sirt3和SOD2 mRNA表達(dá)；western blotting和免疫共沉淀檢測(cè)Sirt3和SOD2蛋白表達(dá)及SOD2乙?；?；免疫熒光檢測(cè)Sirt3在聽皮層的定位表達(dá)。
　　結(jié)果：與自然老化組相比，4月齡，10月齡和18月齡D-半乳糖組中MDA水平分別升高1.18倍,1.39倍(P<0.05)和1.32倍(P<0.05)，SOD2活性

9、分別下降1.21倍,1.36倍(P<0.05)和4.50倍(P<0.01)；CD水平分別升高1.51倍,1.87倍和1.90倍(P<0.01)；Sirt3 mRNA表達(dá)分別下降1.32倍（P<0.05）,1.70倍（P<0.01）和4.46倍（P<0.01）；SOD2 mRNA表達(dá)分別下降1.06倍,1.11倍（P>0.05）和2.04倍（P<0.01）； Sirt3的蛋白表達(dá)分別下降1.46倍,2.10倍和3.47倍（P<0.01），

10、SOD2蛋白水平降低1.03倍,1.10倍（P>0.05）和2.27倍（P<0.05）；SOD2乙?；缴?.70倍,3.09倍和3.31倍（P<0.01）。
　　結(jié)論：D-半乳糖誘導(dǎo)的擬老化聽皮層中Sirt3表達(dá)下降，使其脫乙酰化SOD2的能力降低，導(dǎo)致SOD2抗氧化活性下降，ROS產(chǎn)生增多，氧化應(yīng)激出現(xiàn)。氧化應(yīng)激在聽皮層細(xì)胞中蓄積，mtDNA受到氧化損傷，發(fā)生缺失突變，導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常，聽皮層細(xì)胞凋