褪黑素對(duì)D-半乳糖促衰老大鼠心肌線粒體保護(hù)作用的研究.pdf

1、1.背景
　　 如何延緩衰老是老年醫(yī)學(xué)面臨的重大挑戰(zhàn)。衰老的自由基理論認(rèn)為，衰老是細(xì)胞成分累積性氧化損傷的結(jié)果。線粒體生成的活性氧是隨齡累積性氧化損傷的主要原因，衰老與自由基的關(guān)系是通過線粒體實(shí)現(xiàn)的，由此導(dǎo)致衰老的自由基一線粒體理論的出現(xiàn)。
　　 對(duì)于心肌線粒體代謝，目前國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行了一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為線粒體在生物能量合成、生成氧化產(chǎn)物及細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)方面具有關(guān)鍵作用，因此，線粒體一直是幾種衰老學(xué)說的中心內(nèi)容.由于對(duì)大

2、分子物質(zhì)氧化損傷的累積，心肌線粒體功能下降可能是衰老導(dǎo)致心臟功能下降的原因。已有研究顯示褪黑素能通過清除氧自由基發(fā)揮抗氧化、抗衰老作用。但是，對(duì)褪黑素對(duì)心肌線粒體衰老防治作用的研究，目前國(guó)內(nèi)外很少報(bào)道。
　　 2.目的
　　 建立人工老化動(dòng)物模型，探討褪黑素對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠心肌線粒體功能及完整性的影響以及對(duì)線粒體衰老是否具有防治作用，為進(jìn)一步探索預(yù)防衰老的新途徑創(chuàng)造條件。
　　 3.研究材料和方法
　

3、　 3.1褪黑素對(duì)D-半乳糖促衰老大鼠心肌能量代謝作用的研究
　　 將SD大鼠隨機(jī)分為：1)對(duì)照組(C組)：3月齡雌雄大鼠各10只，2)致衰老組(D組)：雌雄大鼠各10只，3)致衰老+褪黑素組(M組)：雌雄大鼠各10只，4)自然衰老組(N組)：24個(gè)月雌雄大鼠各10只。致衰老組D-半乳糖125mg/kg/d，皮下注射6周；致衰老+褪黑素組D-半乳糖125mg/kg/d皮下注射6周，加褪黑素10mg/kg/d腹腔內(nèi)注射6周。對(duì)照

4、組每日皮下及腹腔注射等量生理鹽水。造模成功后，用高效液相色譜法測(cè)定各組大鼠左室心肌ATP、ADP、AMP含量，并計(jì)算總腺苷酸量(total adenylic acid number，TAN=ATP+ADP+AMP)。心肌細(xì)胞的能量狀態(tài)用能荷表示，計(jì)算公式：能荷(energycharge，EC)=1/2ADP+ATP/TAN。
　　 3.2褪黑素對(duì)D-半乳糖促衰老大鼠心肌線粒體內(nèi)外細(xì)胞色素C影響的研究
　　 動(dòng)物分組及處理

5、同3.1部分。取各組大鼠左室心肌制作光鏡、免疫組化及免疫熒光標(biāo)本。進(jìn)行HE染色及細(xì)胞色素C、電壓依賴性陰離子通道(VDAC)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ANT)、凋亡抑制蛋白Bcl-2、促凋亡Bax免疫組化及免疫熒光染色。同時(shí)對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行Western blot檢測(cè)，進(jìn)行半定量分析；并用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)各組大鼠心肌外膜VDAC、內(nèi)膜ANT、細(xì)胞色素C mRNA基因表達(dá)水平變化，并進(jìn)行定量分析。
　　 4、結(jié)果
　　 4.1褪黑

6、素對(duì)D-半乳糖促衰老大鼠心肌能量代謝作用的研究
　　 在本組實(shí)驗(yàn)中觀察了不同處理組大鼠左心室的能量代謝狀況。所觀察的參數(shù)包括AMP、ADP、ATP、TAN、及EC值等。方差分析顯示自然衰老組AMP值較其他三組明顯升高，而ADP、ATP、TAN及EC值較其他三組明顯降低(P<0.05)(圖4)；褪黑素處理組(圖2)ATP、TAN值較其他組明顯升高(P<0.05)，EC亦升高，但與D—gal促衰老組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。<

7、br>　　 4.2褪黑素對(duì)D-半乳糖促衰老大鼠心肌線粒體內(nèi)外細(xì)胞色素C影響的研究
　　 褪黑素處理D-半乳糖促衰老大鼠HE染色結(jié)果
　　 病理HE染色發(fā)現(xiàn)，C組M組同D組N組大鼠相比心肌細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞間質(zhì)少，心外膜血管豐富；而D組及N組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，細(xì)胞形態(tài)欠飽滿，細(xì)胞間質(zhì)較多，心外膜血管較少。
　　 褪黑素處理D-半乳糖促衰老大鼠線粒體內(nèi)部分物質(zhì)免疫組化結(jié)果
　　 C組、M

8、組ANT同D組、N組相比染色明顯增強(qiáng)，組間差異明顯(P<0.05)。VDAC及細(xì)胞色素C在C組、M組與D組、N組相比染色明顯減弱，組間差異明顯(P<0.05)。Bax染色在各組間無(wú)明顯差異，心肌外膜染色較中膜增強(qiáng)。免疫熒光顯示同樣結(jié)果。Bcl-2染色弱，在各組間無(wú)明顯差異。
　　 褪黑素處理D-半乳糖促衰老大鼠線粒體內(nèi)基因表達(dá)水平
　　 ANT mRNA表達(dá)量在D組及N組與C組及M組比較明顯增加(P<0.05)。VDAC

9、 mRNA及CYTC mRNA表達(dá)量在D組及N組與C組及M組比較明顯降低(P<0.05)。
　　 褪黑素處理D-半乳糖促衰老大鼠心肌線粒體內(nèi)蛋白表達(dá)水平
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠心肌及線粒體中總蛋白含量在C組最低，而其他三組間無(wú)明顯差異。M組線粒體內(nèi)ANT較其他三組增高、而VDAC較其他三組明顯降低(P<0.05)。細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)在線粒體及胞漿中各組間無(wú)明顯差異，而觀察胞漿及線粒體中細(xì)胞色素C含量比值發(fā)現(xiàn)在D-組及N

10、組與C組及M組比較明顯升高(P<0.05).Bcl-2在對(duì)照組最高(P<0.05)，而其余各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，Bax蛋白水平在各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，但Bcl-2與Bax比值發(fā)現(xiàn)C組及M組較D組及N組明顯增高(P<0.05)
　　 5.結(jié)論
　　 5.1褪黑素加D-半乳糖處理組大鼠心肌能量代謝較其它組強(qiáng)，線粒體功能可能得到較好保護(hù)。
　　 5.21)褪黑素可能通過升高線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C維持