移植脂肪源干細胞對D-半乳糖衰老大鼠的影響.pdf

1、背景:
　　 衰老是整個機體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機能的全面衰退,是一個動態(tài)的、復雜的過程。當前預防和延緩衰老已成為生命科學研究的熱點。原林教授提出的“筋膜學假說”認為人體是由尚未分化的非特異性結(jié)締組織(筋膜)支架所構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)和以已分化功能細胞為基礎(chǔ)的功能系統(tǒng)所共同構(gòu)成。功能系統(tǒng)在支持與儲備系統(tǒng)支持下維持結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定,支持與儲備系統(tǒng)不斷的為功能系統(tǒng)的細胞更新和功能活動提供源源不斷的細胞源泉和細胞活動所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。功能系

2、統(tǒng)是建立在功能細胞的專能特化基礎(chǔ)上的,而支持與儲備系統(tǒng)的筋膜支架是以干細胞為核心,通過分化出各種定向干細胞,為功能系統(tǒng)的更新提供源源不斷的細胞補充,并為功能系統(tǒng)的各種細胞的更新、代謝提供一個穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。衰老是筋膜中干細胞儲備逐漸耗竭的過程,而如何保持筋膜的正常狀態(tài),為功能系統(tǒng)提供穩(wěn)定的細胞來源并維持其向功能細胞的正常分化,是延長生命周期的關(guān)鍵。如果衰老時減少的干細胞能得到及時的補充,為機體提供新的細胞儲備,可修復機體損傷,延緩衰老、

3、延長生命周期。
　　 間充質(zhì)干細胞(menchymal stem cells)具有自我更新、多向分化的能力。最初是由Friendenstein等發(fā)現(xiàn),且證明其在體外可以分化成為成骨細胞及脂肪細胞,而后其它的研究小組發(fā)現(xiàn)骨髓來源的MSCs不僅可以分化為中胚層來源的組織,而且可以分化為內(nèi)胚層和外胚層來源的組織。間充質(zhì)干細胞的多組織來源與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布是一致的,其縱向、橫向分化的生物學特性與筋膜學提出的筋膜結(jié)締組織對機體的

4、支持儲備作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干細胞的一種儲備形式。ADSCs具有多分化潛能,能夠跨胚層分化。ADSCs具有低免疫原性,免疫調(diào)節(jié)功能和分泌細胞因子等能力為異體移植提供了有利條件,使ADSCs成為生物治療的亮點之一；ADSCs分泌細胞因子抗老化的作用,已經(jīng)被臨床廣泛應用。ADSCs不僅可以用來進行各種退行性和衰竭疑難病的替代治療,而且可用來進行輔助的免疫治療。ADSCs可能通過以下機制修復或者重建組織:首先,ADSCs被

5、植入一個受損的或是壞死的組織,它們能以副分泌的方式分泌出細胞活素和生長因子以刺激修復。ADSCs可以提供抗氧化劑、自由基清除劑、熱休克蛋白等給待修復組織,從而清除局部環(huán)境中所釋放的有毒物質(zhì),促進仍存活的細胞的修復。另外,ADSCs可以通過刺激內(nèi)生性干細胞補充到待修復的臟器或自身直接遷移補充到待修復區(qū)域,以調(diào)節(jié)干細胞的微環(huán)境,并且促進它們沿著需要的方式分化為功能細胞,從而更新機體衰老的功能細胞,維持機體平衡。
　　 D-gal所致

6、亞急性衰老模型是國內(nèi)外比較公認的衰老模型。在一定時間內(nèi)連續(xù)給動物注射D-半乳糖使機體細胞糖代謝及脂代謝紊亂,不僅破壞并消耗機體抗氧化防御系統(tǒng)使自由基積聚,同時還使機體細胞膜脂質(zhì)受損,過氧化脂質(zhì)、脂褐素增高,出現(xiàn)衰老。D-半乳糖模型因全面影響細胞的代謝功能和一些重要的酶的功能,所導致的老化較全面。其老化與機能減退具體機制可能與代謝障礙、免疫損傷、自由基損傷及線粒體損傷等相關(guān)。
　　 為探討外源性脂肪源干細胞移植是否具有延緩衰老的作

7、用,本實驗觀察移植ADSCs對D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠自由基及免疫等方面及衰老大鼠學習記憶及性能力等方面的影響,探索一種新的抗衰老機制,為臨床延緩衰老的治療提供新的思路和方法。
　　 目的
　　 研究移植脂肪源干細胞對D-半乳糖致衰老大鼠相關(guān)衰老指標,學習記憶能力及交配能力的影響,進一步為筋膜結(jié)締組織為于細胞的儲備源泉提供證據(jù)支持,為筋膜學提供理論支撐,并探討臨床替代療法的治療機理。
　　 1、判斷非特異

8、性筋膜結(jié)締組織中是否存在脂肪源干細胞；
　　 2、觀察移植脂肪源干細胞能否對D-半乳糖衰老大鼠自由基及免疫功能產(chǎn)生影響,闡述移植脂肪源干細胞對抗D-半乳糖衰老的血清學意義；
　　 3、通過Morris迷宮,研究移植筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細胞能否對D-半乳糖衰老大鼠學習記憶能力產(chǎn)生影響；通過免疫組織化學染色,觀察海馬錐體細胞形態(tài)學變化,及其凋亡狀況。
　　 4、通過交配實驗,研究移植筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細胞能

9、否提高D-半乳糖衰老大鼠的性能力；通過免疫組織化學染色,觀察移植標記的脂肪源干細胞在睪丸組織中的定位和移位情況,及睪丸間質(zhì)細胞分泌3β-HSD情況。通過血清學檢測,觀察睪酮分泌狀況。為“筋膜學”抗衰老相關(guān)理論提供進一步佐證。
　　 方法
　　 1、取成年大鼠腹股溝脂肪摯,酶消化法分離、培養(yǎng)筋膜結(jié)締組織脂肪源干細胞。通過形態(tài)學、功能學、流式細胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織源細胞是否符合間充質(zhì)干細胞的特性,以判斷非特異性筋膜結(jié)

10、締組織中是否含有間充質(zhì)干細胞。
　　 2、90只SD大鼠隨機分成空白對照組(A組)、模型組(B組)和治療組(C組)。B、C組頸背部皮下注射15％D-半乳糖1000mg/(kg·d),連續(xù)8周復制亞急性衰老模型,空白對照組大鼠每天給予生理鹽水1.6ml頸背部皮下注射。
　　 3、造衰老模型成功后,細胞治療組大鼠行脂肪源干細胞靜脈移植。用于移植的第4代ADSCs在進行傳代后,在培養(yǎng)基中摻入10μmol/L的Brdu,培養(yǎng)3天

11、后消化收集,無菌生理鹽水重懸,300萬/ml。每只大鼠經(jīng)尾靜脈注射ADSCs3×106,模型組輸入生理鹽水1ml。
　　 4、移植細胞后第10天開始,連續(xù)5天對各組大鼠進行Morris水迷宮實驗,檢測大鼠空間學習記憶能力。HE染色觀察大鼠海馬區(qū)椎體細胞形態(tài),TLINEL免疫組化染色觀察大鼠海馬區(qū)錐體細胞的凋亡指數(shù)。
　　 5、雌鼠分別在實驗前48h和4h皮下注射苯甲酸雌二醇200μg/kg和黃體酮2mg/kg以誘導雌鼠發(fā)

12、情,用發(fā)情的雌鼠和雄鼠進行交配,從而對雄性進行相關(guān)性能力研究。HE染色顯示大鼠睪丸組織精曲小管結(jié)構(gòu)變化,免疫組化及免疫熒光追蹤移植細胞；免疫組化觀察3β-HSD分泌及大鼠間質(zhì)細胞凋亡指數(shù)。放免法觀察大鼠血清睪酮含量。
　　 結(jié)果
　　 1、非特異筋膜結(jié)締組織源細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學特征,可以形成細胞集落,體外誘導可以分化成成骨細胞、脂肪細胞。
　　 2、連續(xù)皮下注射D-gal可以模擬大鼠衰老。移植ADSC

13、s后,可以明顯提高衰老大鼠T-SOD、CuZn-SOD活性、血清IL-2水平、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù),降低MDA水平(P<0.05)；細胞治療組血清NO水平與模型組比較,無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 3、Morris迷宮顯示移植干細胞后,衰老大鼠空間學習記憶能力提高；TUNEL染色顯示海馬錐體細胞凋亡率降低。
　　 4、移植干細胞后同時可以改善衰老大鼠交配能力,增加交配次數(shù)和撲捉次數(shù)。細胞治療后血清睪酮含量增加,睪丸

14、間質(zhì)細胞分泌3β-HSD增多,而間質(zhì)細胞凋亡率降低。
　　 結(jié)論
　　 1、筋膜結(jié)締組織脂肪源干細胞具有長梭形、多角形的形態(tài)學特征,可以形成細胞集落,與其它組織來源間充質(zhì)干細胞無明顯差別；細胞表面標記物檢測中,4代貼壁ADSCs特異性表面標志物CD90、CD29表達率分別為90％以上,而CD49d、CD11b、CD45陰性表達,而CD106弱表達陽性；該細胞經(jīng)定向誘導后可以成骨、成脂肪,與問充質(zhì)干細胞多向分化的功能一致。

15、可以判斷在發(fā)育成熟大鼠的筋膜結(jié)締組織中存在未分化間充質(zhì)干細胞。
　　 2、連續(xù)頸背部皮下注射D-gal可以有效模擬亞急性衰老模型。衰老大鼠在外觀上及自由基等方面,顯示明顯衰老征象。
　　 3、靜脈移植脂肪源干細胞,可以顯著升高衰老大鼠體內(nèi)SOD含量、IL-2水平,有效降低MDA含量,同時提高胸腺和脾臟指數(shù)。
　　 4、移植脂肪源干細胞可以明顯改善衰老大鼠的空間學習記憶能力,抑制海馬錐體細胞凋亡。
　　 5

16、、移植脂肪源干細胞可以改善衰老老鼠的交配能力,促進睪酮釋放,同時保護睪丸間質(zhì)細胞。
　　 綜上所述,本研究分別采用了細胞分離培養(yǎng)、HE染色和免疫組化等技術(shù)手段,從血清學自由基及免疫功能方面,以及空間學習記憶能力、交配能力等多方面,多角度的探討了移植脂肪源干細胞對D-gal誘導的亞急性衰老大鼠的作用。這是從筋膜學角度研究抗衰老機理的一個新嘗試。本研究發(fā)現(xiàn),補充外源性的脂肪源干細胞可以延緩D-gal誘導的衰老,提高其生命質(zhì)量。從而為