衰老蛋白p66shc在D-半乳糖誘導小鼠內(nèi)耳老化中的作用及其機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 D-半乳糖誘導內(nèi)耳老化小鼠模型的建立
　　目的:利用D-半乳糖建立小鼠內(nèi)耳老化模型。
　　方法:用800mg/kg、1000mg/kg D-半乳糖生理鹽水水溶液分別對兩組雄性昆明小鼠進行每日一次的頸背部皮下注射,每個劑量組小鼠為6只,共十周。以同等體積的生理鹽水給予相同處理的6只雄性小鼠作為對照組。ABR檢測小鼠聽閾;分光光度法檢測小鼠血漿 T-SOD活性及MDA水平;實

2、時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real time PCR)檢測各組小鼠耳蝸外側(cè)壁 DNA3873 bp大片段缺失率,并且所得產(chǎn)物進行測序。
　　結(jié)果:ABR測得結(jié)果顯示各組之間并無明顯差異;兩組 D-半乳糖組的血漿 T-SOD活性較對照組降低,且高劑量組低于低劑量組;兩組 D-半乳糖組的血漿 MDA水平增高,且高劑量組低于低劑量組;半乳糖處理組線粒體大片段缺失率較對照組顯著升高(p<0.01)。
　　結(jié)論:D-半乳糖可引起小鼠內(nèi)耳

3、老化改變。
　　第二部分 p66shc在正常成年小鼠及不同年齡段小鼠內(nèi)耳中的表達
　　目的:研究 p66shc在正常小鼠內(nèi)耳中的表達部位及表達水平。
　　方法:①正常成年昆明小鼠10只。免疫熒光檢測 SHC蛋白在小鼠耳蝸中的表達部位。實時熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)檢測 p66shc小鼠耳蝸及肝臟中的表達水平。
　?、谀挲g為3天、1個月、3個月、12個月的小鼠各8只,Western blot檢測 p66shc及Ser36

4、-P-p66shc在不同年齡段小鼠中耳蝸中的表達水平。
　　結(jié)果:①SHC蛋白在成年小鼠耳蝸中主要表達在血管紋處;p66shc在成年小鼠中耳蝸表達量較肝臟高達40倍。
　?、赟HC蛋白在3天小鼠表達量明顯較1、3、12個月小鼠高。Ser36-P-p66shc在1、3、12個月小鼠表達水平明顯較3天小鼠高。
　　結(jié)論:p66shc在內(nèi)耳血管紋中高表達,SHC及Ser36-P-p66shc蛋白的表達與年齡相關(guān)。
　　

5、第三部分 p66shc在 D-半乳糖誘導內(nèi)耳線粒體 DNA損傷中的作用及其作用機制
　　目的:探討 p66shc在 D-半乳糖誘導內(nèi)耳線粒體 DNA損傷中的作用及其作用機制。
　　方法:60只昆明小鼠隨機分為3組:D-半乳糖低、高劑量組及生理鹽水對照組,分別每日于皮下注射 D-半乳糖水溶劑800mg/kg,1000mg/kg及等體積的生理鹽水,共十周。實時定量 PCR檢測各組小鼠耳蝸 p66shc、FOXO3a mRNA水平

6、。Western blot檢測各組小鼠耳蝸中p66shc、FOXO3a、p-FOXO3a、Ser36-P-p66shc總蛋白水平以及p66shc線粒體蛋白水平。免疫熒光檢測 Ser36-P-p66shc在各組小鼠耳蝸外側(cè)壁中的表達。
　　結(jié)果:與對照組相比,低高劑量組 p66shc、FOXO3a mRNA表達水平增高;p66shc、FOXO3a、p-FOXO3a、Ser36磷酸化 p66shc總蛋白水平以及p66shc線粒體蛋白水