PI3K通過(guò)RhoA-mDia1信號(hào)通路介導(dǎo)凝血酶誘導(dǎo)的血小板Actin細(xì)胞骨架重構(gòu).pdf

1、背景和目的：
　　血小板為含顆粒無(wú)核盤(pán)狀細(xì)胞，凝血酶等激動(dòng)劑能夠誘發(fā)血小板表面整合素受體GPαⅡbβ3變構(gòu)活化(“inside-out”信號(hào)），使其對(duì)配體（主要是纖維蛋白原，F(xiàn)g）親和力顯著增高，由此導(dǎo)致血小板在固化Fg表面的鋪展以及懸浮血小板的聚集，驅(qū)動(dòng)這種鋪展和聚集的動(dòng)力是Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）在凝血酶誘導(dǎo)的GPαⅡbβ3變構(gòu)活化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其在活化GPαⅡbβ3誘發(fā)的Actin細(xì)胞骨架

2、重構(gòu)(“outside-in”信號(hào)）過(guò)程中的作用尚不清楚。
　　mDia1(mammaliandiaphanous)是黑腹果蠅翅膀中diaphanous蛋白的同源物，屬于Formin相關(guān)蛋白家族。其作為細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白，主要參與調(diào)控細(xì)胞分裂、極化、運(yùn)動(dòng)、張力絲的形成及神經(jīng)突的生長(zhǎng)等細(xì)胞骨架重構(gòu)過(guò)程。mDia1作為小分子GTP酶RhoA的下游分子，通過(guò)與Actin結(jié)合蛋白profilin的相互作用參與調(diào)控Actin細(xì)胞骨架的重構(gòu)。m

3、Dia1是有核細(xì)胞中Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)的主要調(diào)控蛋白，但其在血小板Actin細(xì)胞骨架調(diào)控中的作用尚不清楚。本課題通過(guò)分析mDia1在人源性血小板中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位，以研究該蛋白在血小板鋪展和聚集等Actin細(xì)胞骨架重構(gòu)過(guò)程中的作用及PI3K對(duì)該調(diào)控過(guò)程的影響。
　　方法：①免疫熒光法檢測(cè)mDia1及F-actin在血小板中的表達(dá)及分布；②采用血小板聚集儀檢測(cè)Wortmannin和抗mDia1抗體導(dǎo)入對(duì)血小板聚集率的影響；③W

4、esternblot檢測(cè)mDia1在血小板靜止、鋪展及聚集過(guò)程中的表達(dá)及其與Actin細(xì)胞骨架的關(guān)系；④GSTpull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同狀態(tài)血小板內(nèi)小分子GTP酶RhoA、Rac1和Cdc42活性變化；⑤免疫共沉淀法檢測(cè)不同狀態(tài)血小板內(nèi)RhoA、Rac1和Cdc42與mDia1相互結(jié)合情況。
　　結(jié)果：①mDia1在靜止、凝血酶誘導(dǎo)的鋪展或聚集血小板內(nèi)表達(dá)總量沒(méi)有明顯差異；②在血小板不同鋪展程度下，mDia1與F-actin均

5、呈共定位狀態(tài)；③凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集過(guò)程中，mDia1從Triton-X100可溶性胞漿部分向Triton-X100不可溶性細(xì)胞骨架部分轉(zhuǎn)位；④抗mDia1抗體導(dǎo)入血小板后能夠抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板鋪展和聚集；⑤PI3K抑制劑Wortmannin能夠抑制血小板聚集，抑制mDia1從Triton-X100可溶性部分向Triton-X100不可溶性部分的轉(zhuǎn)位；⑥Wortmannin可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板鋪展，表現(xiàn)為張力絲和片狀偽足形成及

6、mDia1和F-actin共定位受阻；⑦凝血酶能夠誘導(dǎo)鋪展或聚集血小板中RhoA活性上調(diào)，且活化態(tài)血小板中RhoA-GTP與mDia1相結(jié)合的量顯著增高，但是Wortmannin能夠阻斷由凝血酶引起的活化態(tài)血小板中RhoA活性上調(diào)，并阻斷凝血酶引起的RhoA-GTP與mDia1的結(jié)合。⑧凝血酶雖能上調(diào)聚集血小板中Rac1和Cdc42的生物活性，但并未誘發(fā)其與mDia1結(jié)合，該過(guò)程也不能被Wortmannin阻斷。
　　結(jié)論：①Rh