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文檔簡介
1、目的:
EphBs 受體及ephrinBs 配體存在于成年的大腦及外周組織中,在各種病理過程、生理功能中具有重要作用。我們最近的研究發(fā)現(xiàn),ephrinBs 作為致敏物質(zhì),通過激活外周ephrinBs / EphBs 信號系統(tǒng)引起外周敏感化和痛覺過敏,但是機(jī)制尚未明了。PI3K 涉及眾多生理功能和病理過程的調(diào)節(jié)。研究證明PI3K 信號通路參與傷害性信息調(diào)制,介導(dǎo)傷害刺激引起的外周、中樞敏感化,如介導(dǎo)NGF/TrkA 和GDN
2、F/Ret 信號激活引起的外周敏感化和痛覺過敏等。已有實驗證實PI3K 參與調(diào)節(jié)EphBs 受體的激活。本研究目的是證明PI3K 是否參與介導(dǎo)外周ephrinBs / EphBs信號激活引起的痛行為。
方法:
1、足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl 后分別于10min、30min、1h、4h 及8h 時間點取足底注射部位皮膚, 用蛋白電泳檢測外周注射ephrinB1-Fc 引起相應(yīng)注射部位皮
3、膚PI3K-p110γ及pAkt 表達(dá)變化的時間相。
2、足底注射ephrinB1-Fc 0.02μg、0.1μg、0.5μg/10μl,30min 后,用蛋白電泳檢測外周注射ephrinB1-Fc 引起相應(yīng)注射部位皮膚PI3K-p110γ及pAkt 表達(dá)變化的劑量依賴性。
3、足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl,15min 后,使用免疫熒光方法檢測ephrinB1-Fc相應(yīng)注射部位皮膚pA
4、kt 表達(dá)的增加是否存在于外周傷害性感受器中;檢測注射側(cè)腰5 DRG pAkt 表達(dá)變化及pAkt 與NK1 受體共表達(dá)情況。
4、PI3K 抑制劑wortmannin 0.4μg/10μl 或LY294002 5μg/10μl 預(yù)處理,30min 后足底同一部位注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl,ephrinB1-Fc 注射30min 后用蛋白電泳檢測相應(yīng)注射部位皮膚pAkt 表達(dá)變化,研究Akt 的激活是
5、否通過PI3K 介導(dǎo)。
5、PI3K 抑制劑wortmannin 0.016、0.08、0.4μg/10μl 和LY294002 0.2、1、5μg/10μl預(yù)處理30min 或后處理1h,足底同一部位注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl,檢測預(yù)處理組ephrinB1-Fc 注射后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h 及48h 和后處理組ephrinB1-Fc注射后2h 的熱縮足反射潛伏期、機(jī)械縮足反射閾值
6、,觀察注射PI3K 抑制劑對ephrinB1-Fc 引起的痛行為的影響。
6、PI3K 抑制劑wortmannin 0.4μg/10μl 和LY294002 5μg/10μl 預(yù)處理30min 或后處理1h,檢測ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl 足底注射后1h(預(yù)處理組)或2h(后處理組)腰4、5 脊髓背角Fos 蛋白的表達(dá)。
7、PI3K 抑制劑wortmannin 0.016、0.08、0.4
7、μg/10μl 或LY294002 0.2、1、5μg/10μl預(yù)處理30min,足底注射ephrinB1-Fc 0.5μg/10μl,30min 后使用蛋白電泳法檢測相應(yīng)注射部位皮膚pERK的表達(dá),研究PI3K在ephrinB1-Fc 引起的注射部位皮膚ERK激活中的作用。
結(jié)果:
1、足底注射ephrinB1-Fc 后相應(yīng)注射部位皮膚PI3K-p110γ表達(dá)呈時間依賴性、劑量依賴性增加,30min 達(dá)到最
8、高峰,8h 恢復(fù)基礎(chǔ)水平;pAkt 表達(dá)呈時間依賴性、劑量依賴性增加,10min 即可檢測到明顯增加,30min 到1h 間達(dá)到最高峰,持續(xù)至少8h。足底注射ephrinB1-Fc 15 min 后注射部位皮膚pAkt 的表達(dá)增加主要集中在傷害性感受器密集的表皮;注射側(cè)腰5 DRG pAkt 表達(dá)增加,并且部分與NK1受體共表達(dá)。PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理能阻斷ephrinB1-Fc 引起的足底皮膚
9、pAkt 表達(dá)的增加。
2、PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理或后處理能防止或逆轉(zhuǎn)ephrinB1-Fc足底注射引起的熱、機(jī)械痛覺過敏,并且隨劑量的增加抑制程度增加。3、PI3K 抑制劑wortmannin 或LY294002 預(yù)處理或后處理能防止或逆轉(zhuǎn)ephrinB1-Fc足底注射引起的脊髓背角Fos 蛋白表達(dá)的增加。
4、PI3K 抑制劑wortmannin 或LY29400
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