MCP-1-PI3K-Akt信號(hào)通路參與骨癌痛調(diào)控及機(jī)制.pdf

1、第一部分：MCP-1通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路活化體外大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞
　　目的:觀察MCP-1在體外通過(guò)細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的激活作用。
　　方法:將體外培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分為六組：空白對(duì)照組（I組）、MCP-11min組（II組）、MCP-110min組（III組）、MCP-120min組（IV組）、MCP-130min組（V組）、MCP-1+LY294002組（VI組）。收集細(xì)胞，通過(guò)免疫組

2、化（n=4）、免疫熒光（n=4）、Western blots（n=4）的方法檢測(cè)每組細(xì)胞p-Akt和OX-42的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示：與其他組比較，II、III組小膠質(zhì)細(xì)胞p-Akt的MOD值顯著增加(P<0.01)；II組p-Akt的MOD值與III組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I、IV、V、VI各組之間p-Akt表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。免疫熒光和Western Blots結(jié)果顯示：與I組相比，

3、III組小膠質(zhì)細(xì)胞p-Akt和OX-42表達(dá)顯著增加(P<0.05)；VI組與III組相比p-Akt和OX-42表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論: MCP-1可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路活化體外大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　第二部分：MCP-1激活骨癌痛大鼠脊髓背角PI3K/Akt信號(hào)通路
　　目的:觀測(cè)在骨癌痛大鼠模型鞘內(nèi)注射MCP-1中和抗體后，其痛閾的改變以及脊髓背角p-Akt表達(dá)的變化。
　　方法

4、: SPF級(jí)雌性 Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體重190~210g，隨機(jī)分為5組（n=8）：假手術(shù)組（I組），于大鼠左側(cè)骨干骺端骨髓腔內(nèi)注射10μl PBS液；假手術(shù)+MCP-1中和抗體組（II組），在注射 PBS液后7~9d鞘內(nèi)注射 MCP-1中和抗體(1μg/μl)10μl，每天1次；骨癌痛組（III組），于大鼠左后肢脛骨干骺端骨髓腔內(nèi)注射乳腺癌細(xì)胞Walker25610μl(2×107/ml)構(gòu)建脛骨癌痛模型；

5、骨癌痛+對(duì)照IgG組(IV組)，在注射腫瘤細(xì)胞后7~9d鞘內(nèi)注射對(duì)照IgG(1g/L)10μl，每天1次；骨癌痛+MCP-1中和抗體組（V組），在注射 Walker256細(xì)胞后7~9d鞘內(nèi)注射 MCP-1中和抗體(1g/L)10μl，每天1次。觀測(cè)術(shù)前1d，術(shù)后1、3、5、7、8、9d各組大鼠機(jī)械痛閾。術(shù)后9d給藥測(cè)痛后處死大鼠，取各組大鼠的L4-6脊髓組織進(jìn)行免疫熒光染色和Western Blots，檢測(cè)脊髓背角p-Akt的表達(dá)。

6、r>　　結(jié)果:與I組相比，骨癌痛（III、IV組）大鼠機(jī)械痛閾明顯下降(P<0.01)，脊髓背角p-Akt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，而II組上述指標(biāo)無(wú)明顯差別(P>0.05)。與III組或IV組比較，V組鞘內(nèi)注射MCP-1中和抗體后能明顯提高骨癌痛大鼠的機(jī)械痛覺(jué)閾值(P<0.01)，降低脊髓背角p-Akt的表達(dá)(P<0.01)。
　　結(jié)論: MCP-1可能通過(guò)激活脊髓背角PI3K/Akt信號(hào)通路參與大鼠骨癌

7、痛的發(fā)生。
　　第三部分：鞘內(nèi)注射LY294002緩解大鼠骨癌痛
　　目的:觀察鞘內(nèi)注射PI3K抑制劑LY294002后，骨癌痛大鼠在疼痛行為學(xué)和脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及活化方面的改變。
　　方法: SPF級(jí)雌性 Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體重190~210g，隨機(jī)分為5組（n=8）：假手術(shù)組（I組）、假手術(shù)+LY294002組（II組）、骨癌痛組（III組）、骨癌痛+5％DMSO（IV組）、骨

8、癌痛+LY294002組（V組）,于大鼠左側(cè)脛骨干骺端骨髓腔內(nèi)注射Walker256乳腺癌細(xì)胞10μl(2×107/ml)構(gòu)建脛骨癌痛模型。術(shù)后7~9d鞘內(nèi)連續(xù)注射PI3K抑制劑LY2940022.5μg/10μl或5%DMSO10μl。觀測(cè)術(shù)前1d，術(shù)后1、3、5、7、8、9d大鼠機(jī)械痛閾值。術(shù)后7d給藥前及給藥后1~8小時(shí)，每小時(shí)測(cè)定各組大鼠機(jī)械痛閾值。術(shù)后9d給藥后處死大鼠，取各組大鼠的L4~6脊髓組織進(jìn)行免疫熒光染色和Weste

9、rn Blots，檢測(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX-42的表達(dá)。
　　結(jié)果:與I組相比，骨癌痛（III、IV組)大鼠機(jī)械痛閾明顯下降(P<0.01)，脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，OX-42表達(dá)增加(P<0.01)，而II組上述指標(biāo)無(wú)明顯差別(P>0.05)。與III、IV組比較，V組在鞘內(nèi)注射LY294002后2~4h痛閾明顯升高(P<0.05)，3h達(dá)到峰值(P<0.01)，連續(xù)鞘內(nèi)注射3d后能明顯提高骨癌痛大鼠的機(jī)械痛覺(jué)閾