胃癌PI3K-AKt-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的協(xié)同與耐藥機(jī)制.pdf

1、第一部分依維莫司聯(lián)合MK2206對(duì)PTEN缺失胃癌細(xì)胞的協(xié)同作用
　　背景:晚期胃癌患者治療效果較差，中位生存期僅一年左右，急需新的方法來(lái)改善這類患者預(yù)后，而分子靶向治療是近年來(lái)發(fā)展最快的治療策略。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑依維莫司(Everolimus，RAD001)是靶向mTORC1的化合物，臨床前研究提示依維莫司可以負(fù)反饋地引起上游絲氨酸蘇氨酸蛋白酶Ak

2、t的激活，從而影響抗腫瘤效果。本研究將觀察加入Akt抑制劑劑MK2206后是否能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)抗腫瘤效果，并進(jìn)一步闡明兩藥協(xié)同的機(jī)制。
　　方法:我們首先從6株人胃癌細(xì)胞株中篩選出一株對(duì)依維莫司敏感的細(xì)胞株作為研究對(duì)象，檢測(cè)依維莫司和MK2206單藥或兩藥聯(lián)合后對(duì)細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬的影響以及對(duì)mTOR通路上游及下游相關(guān)蛋白、ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期蛋白、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。<

3、br>　　結(jié)果:我們的研究顯示，依維莫司和MK2206能夠協(xié)同地作用于PTEN(phosphatase and tensin homolog)突變的胃癌HGC-27細(xì)胞株，在細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡上均具有協(xié)同作用。依維莫司和MK2206所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡并非由于細(xì)胞凋亡，兩藥作用于HGC-27細(xì)胞后可協(xié)同引起自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)抗體和自噬相關(guān)基因beclin-1的表達(dá)，提示這種細(xì)胞死亡可能是自噬性細(xì)胞死亡

4、。在依維莫司聯(lián)合MK2206處理細(xì)胞的同時(shí)加入自噬抑制劑3甲基腺嘌呤和氯喹，死亡細(xì)胞減少，這進(jìn)一步提示細(xì)胞自噬性死亡，而非凋亡性死亡在依維莫司和MK2206共同作用導(dǎo)致的細(xì)胞死亡中占主要作用。在機(jī)制研究中，我們發(fā)現(xiàn)依維莫司與MK2206的聯(lián)合強(qiáng)化了對(duì)Akt/mTOR通路的抑制、對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞ERK/MAPK通路的激活。用MEK/ERK抑制劑PD98059和U0126可以抑制依維莫司聯(lián)合MK20

5、206引起的beclin-1的表達(dá)、自噬作用以及HGC-27細(xì)胞的死亡;用beclin-1 siRNA可以抑制細(xì)胞自噬，但對(duì)MAPK的表達(dá)沒(méi)有影響。
　　結(jié)論:PETN缺失的胃癌細(xì)胞對(duì)依維莫司較為敏感;依維莫司聯(lián)合MK2206能夠?qū)GC-27細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用，其機(jī)制中包含了ERK依賴的細(xì)胞自噬性死亡通路。
　　第二部分導(dǎo)致依維莫司耐藥的關(guān)鍵信號(hào)通路
　　背景:以往的臨床研究證明，依維莫司在胃癌中的療效還不夠理想

6、，治療有效的胃癌患者很容易產(chǎn)生對(duì)依維莫司的繼發(fā)性耐藥。由于mTOR處于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路的中心位置，與細(xì)胞內(nèi)許多其他信號(hào)通路均有聯(lián)系，因此在胞內(nèi)尋找其關(guān)鍵耐藥機(jī)制難度較大，本研究將首先從位于胞膜的酪氨酸激酶受體入手，初步探索引起敏感胃癌細(xì)胞株HGC-27對(duì)依維莫司耐藥的關(guān)鍵信號(hào)通路。
　　方法:我們首先通過(guò)加藥誘導(dǎo)培養(yǎng)出穩(wěn)定的耐依維莫司(RAD001)的HGC-27細(xì)胞（HGC-27-resistant to

7、RAD001，HGC-27-RR），然后用高通量蛋白芯片篩選出這兩株遺傳學(xué)背景相同的細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白，之后挑選出部分差異表達(dá)的位于胞膜的酪氨酸激酶受體，驗(yàn)證這些差異蛋白是否介導(dǎo)了HGC-27細(xì)胞對(duì)依維莫司的耐藥。
　　結(jié)果:高通量蛋白芯片篩選的結(jié)果顯示，與HGC-27細(xì)胞相比，HGC-27-RR細(xì)胞中EGFR，PDGFR，F(xiàn)GFR，VEGFR的某些位點(diǎn)的磷酸化增多。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HGC-27-RR磷酸化FGFR1的表達(dá)較HGC

8、-27明顯高，并且用FGFR1的抑制劑TSU68可以明顯抑制HGC-27-RR細(xì)胞的生長(zhǎng)。這提示FGFR1通路可能在HGC-27細(xì)胞對(duì)依維莫司耐藥的過(guò)程中起了重要的作用。在功能驗(yàn)證中，我們發(fā)現(xiàn)用bFGF刺激HGC-27細(xì)胞后可以引起該細(xì)胞對(duì)依維莫司的耐藥，并且FGFR抑制劑AZD4547可以逆轉(zhuǎn)由bFGF介導(dǎo)的HGC-27對(duì)依維莫司的耐藥。
　　結(jié)論:FGFR通路激活在HGC-27細(xì)胞對(duì)依維莫司產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的過(guò)程中起了重要作用，但