烏索酸抑制PI3K-AKt-mTOR信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞損傷.pdf

1、前言
　　糖尿病(diabetic)的發(fā)病率近十年在世界范圍內(nèi)迅速增長，糖尿病腎病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎臟病的最常見原因[1]。據(jù)報(bào)道30-40％的1型糖尿病患者和5-10％的2型糖尿病患者將最終發(fā)展到終末期腎病(ESRD)[2]。明確一種阻止這種疾病進(jìn)一步進(jìn)展的因素，是一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。
　　腎小球硬化癥是糖尿病腎臟病的典型病理特征[3]。其主要是細(xì)胞外基質(zhì)蛋

2、白如膠原蛋白及纖維連接蛋白沉積于系膜細(xì)胞間質(zhì)區(qū)，并通過降低腎小球毛細(xì)血管濾過面積，導(dǎo)致糖尿病腎臟病的進(jìn)一步進(jìn)展[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（AKt）在基質(zhì)沉積中起重要作用，它參與了高糖條件下系膜細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)上調(diào)，并作為一種促纖維化細(xì)胞因子被認(rèn)為在糖尿病腎小球硬化方面扮演重要角色[5,6]。
　　PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路是一條經(jīng)典信號(hào)通路，調(diào)節(jié)著糖代謝、糖原合成、蛋白合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞肥大以及細(xì)

3、胞死亡[7]等許多細(xì)胞功能。據(jù)報(bào)道PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路參與糖尿病腎病的發(fā)病[8-11]。
　　烏索酸(Ursolicacid,UA)是一個(gè)來源于植物的五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于漿果、水果及草藥中。具有抗腫瘤、抗肝臟纖維化、降血糖、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[12-16]。烏索酸通過抑制PI3K/AKt信號(hào)通路活化，抑制Jurkat細(xì)胞（惡性腫瘤細(xì)胞）增殖，誘導(dǎo)其凋亡[27]從而起到抗腫瘤作用;同時(shí)烏索酸通過降低TG

4、F-βmRNA的表達(dá)，抑制人肝星狀細(xì)胞(HSC)增殖，誘導(dǎo)其凋亡，從而緩解肝纖維化的惡性循環(huán);在糖尿病腎病研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)烏索酸可以通過抑制STAT-3、ERK1/2、JNK通路活化，抑制iNOS過表達(dá)，緩解STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型的腎小球肥大和細(xì)胞外基質(zhì)增多，延緩DN的進(jìn)展[17]，但其詳細(xì)的保護(hù)機(jī)制目前尚不明確。
　　本研究用體外培養(yǎng)的人系膜細(xì)胞觀察高糖刺激對(duì)細(xì)胞增殖及活性氧簇產(chǎn)生的影響，觀察PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路的

5、變化，明確烏索酸對(duì)系膜細(xì)胞的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討烏索酸保護(hù)系膜細(xì)胞的分子機(jī)制。
　　為此我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn):
　　目的
　　1.明確PI3K/Akt信號(hào)通路是否參與調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)下的系膜細(xì)胞增殖及ECM沉積。
　　2.烏索酸是否對(duì)高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞有保護(hù)作用，保護(hù)依據(jù)是否通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路活化，抑制系膜細(xì)胞增殖，抑制TGF-β1表達(dá)及ECM沉積。
　　3.發(fā)現(xiàn)烏索酸新的治療方向，為中草

6、藥治療DN提供新的依據(jù)。
　　方法
　　將體外培養(yǎng)人系膜細(xì)胞分為正常葡萄糖組(NG)、甘露醇高滲對(duì)照組(Mannitol)、高糖組(HG)、烏索酸干預(yù)組(UA)，采用MTT法檢測(cè)系膜細(xì)胞增殖;PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;AnnexinⅤ-FITC雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)系膜細(xì)胞凋亡;DCFH-DA測(cè)定系膜細(xì)胞活性氧簇產(chǎn)生;Western-blot檢測(cè)系膜細(xì)胞PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路AKt、p-AKt、mTOR、p-m

7、TOR表達(dá)，細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白TGF-β1、FN表達(dá)，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白survivin表達(dá)，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xl、Bax、survivin表達(dá);實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)TGF-β1、FN、survivin、Bcl-xl、BaxmRNA表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1.HG刺激RMC48h，細(xì)胞異常增殖(p＜0.05VSNG)，UA以劑量依賴的方式抑制HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖(p＜0.05VSHG)。
　　2.UA促進(jìn)系膜細(xì)胞的

8、早期凋亡(p＜0.05VSHG)，維持細(xì)胞正常增殖水平。
　　3.UA抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞活性氧簇產(chǎn)生，抑制氧化應(yīng)激，減少系膜細(xì)胞損傷。
　　4.UA抑制高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞AKt、mTOR磷酸化水平(p＜0.05VSHG)，抑制TGF-β1、FN蛋白及mRNA表達(dá)(p＜0.05VSHG)，抑制細(xì)胞增殖基因survivin蛋白及mRNA表達(dá)(p＜0.05VSHG)，抑制抗細(xì)胞凋亡基因Bcl-xl蛋白及mRNA表達(dá)(p＜0.0