苦豆堿通過抑制PI3K-AKT-mTOR通路減輕小鼠腎臟缺血再灌注的損傷.pdf

1、目的：研究苦豆堿對腎臟缺血再灌注的保護作用及可能的作用機制。
　　方法：通過使用動脈夾夾住小鼠雙側腎蒂45分鐘然后再松開動脈夾的方法建立小鼠腎臟缺血再灌注模型。18只C57/B6小鼠隨機分為三組：
　　(1)缺血再灌注—苦豆堿組，缺血再灌注前連續(xù)8天灌胃給與苦豆堿（Q1962,卡邁舒，上海）預處理，苦豆堿溶解于含10％冰乙酸的生理鹽水中（2.5mg/ml），給藥濃度為50mg/kg；第9天行缺血再灌注手術，其中缺血45min

2、，再灌注24h后犧牲小鼠。
　　(2)缺血再灌注—介質組：缺血再灌注前給予等量的含10%冰乙酸的生理鹽水預處理；第9天行缺血再灌注手術，其中缺血45min，再灌注24h后犧牲小鼠。
　　(3)假手術組：類似缺血再灌注手術流程但不使用動脈夾，給予等量的含10%冰乙酸的生理鹽水預處理，再灌注24小時后犧牲小鼠。收集血清和腎臟組織樣品。通過血清檢測肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平以反映腎功能。HE和PAS染色用來評價腎臟損傷程度

3、，包括：腎小管壞死，刷狀緣和基底膜的完整程度以及管型形成的多少。腎臟組織切片進行MPO和F4/80的免疫組織化學染色以定量分析中性粒細胞和巨噬細胞的炎性浸潤。IL-1β，IL-10和 IFN-γ通過RT-PCR來檢測。腎小管上皮細胞的凋亡是通過TUNEL檢測試劑盒以及Caspase3的蛋白表達水平來檢測。SOD和MDA的水平和活性通過南京建成生物研究所的SOD和MDA檢測試劑盒檢測。PI3Kp85，Akt，mTOR，NFκBp65，c-

4、fos和Bcl2的表達水平和活性通過Western Blot來檢測。NFκBp65和AP-1（c-fos）的DNA結合活性通過凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)來檢測。
　　結果：與缺血再灌注—介質組相比，缺血再灌注—苦豆堿組的小鼠腎臟功能和形態(tài)學改變明顯受到保護；中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤情況也明顯減少；同時促炎細胞因子IL-1β和IFN-γ的水平也相應減少，而抗炎因子IL-10則增多。苦豆堿預處理的缺血再灌注小鼠比缺血再灌注對照組

5、小鼠的腎小管上皮細胞凋亡減少；SOD的水平則相應增加，這表明ROS的聚集減少；總的PI3Kp85，Akt,mTOR和NFκB p65的蛋白表達水平無明顯差別，但是磷酸化的PI3Kp85，Akt,mTOR和NFκB p65的表達水平則減少，c-fos和Bcl2相應增加，NFκB與c-fos的EMSA結果與Western Blot相似，而假手術組的所有檢測指標都相應正常。
　　結論：苦豆堿可以減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷，其作用機制可能