心肌缺血后適應(yīng)通過nNOS-AMPK-mTOR通路增強自噬活性減輕缺血再灌注損傷.pdf

1、背景:急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是世界范圍內(nèi)死亡率較高的疾病之一。及時恢復(fù)（再灌注）缺血心肌的血流供應(yīng)成為治療這些患者的標(biāo)準(zhǔn)療法。然而在早期階段再灌注會給心肌組織帶來進(jìn)一步更嚴(yán)重的損傷即缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)有著明顯的心肌保護(hù)作用，但是由于急性心梗的不可預(yù)知性其臨床應(yīng)用受到限制。近年來缺血后適應(yīng)(ischemic post

2、conditioning，IPostC)由于和預(yù)適應(yīng)有著相似的心肌保護(hù)作用以及臨床可操作性受到了廣泛關(guān)注，但其作用機制尚未完全清楚，有必要進(jìn)一步完善研究。
　　據(jù)報道自噬參與心肌I/R的發(fā)展過程。也有研究表明自噬受到后適應(yīng)的調(diào)節(jié)。再灌注早期大量生成的活性氧(reactive oxygen species，ROS)引發(fā)誘導(dǎo)的自噬同時也能夠降低ROS水平，減輕氧化應(yīng)激。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal n

3、itric oxide synthase，nNOS）參與后適應(yīng)減輕氧化應(yīng)激和鈣超載，具有抑制I/R損傷的心肌保護(hù)作用。后適應(yīng)能夠恢復(fù)nNOS活性，其合成的NO影響腺苷單磷酸激活蛋白激酶(adenosine5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK）的活性，從而對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycinm，mTOR)即自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器產(chǎn)生

4、作用。但是自噬、后適應(yīng)與nNOS之間在缺血再灌注損傷及保護(hù)作用中的相互關(guān)系尚未明晰。我們推測nNOS可能參與后適應(yīng)對自噬的調(diào)節(jié)，后適應(yīng)可能部分通過nNOS介導(dǎo)的通路促進(jìn)自噬減輕I/R損傷。
　　目的:研究自噬在后適應(yīng)心肌保護(hù)中的作用，探討nNOS在缺血后適應(yīng)調(diào)控自噬活性中的作用。
　　方法:隨機選擇C57/B6雄性小鼠，建立小鼠在體心臟缺血再灌注損傷模型與缺血后適應(yīng)模型;用缺氧罐建立H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型與缺氧后

5、適應(yīng)模型;用Western Blot檢測組織和細(xì)胞樣本中各組LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、p-AMPK(Thr172)、p-mTOR、p-nNOS(Ser852)以及nNOS蛋白的表達(dá)含量;用透射電鏡觀察各組樣本中自噬體個數(shù)及線粒體形態(tài)。用共聚焦顯微鏡觀察被GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞中自噬體個數(shù);用TTC試劑盒測定心肌梗死面積;利用HE染色對心肌組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察測定;利用ROS試劑盒檢測細(xì)胞中ROS生成量;使用Annexin

6、V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒測定細(xì)胞凋亡率;用CCK-8試劑盒測定細(xì)胞活性;用線粒體膜電位檢測試劑盒測定各組細(xì)胞的線粒體膜電位。
　　結(jié)果:1)與I/R組相比，IPostC組nNOS活性恢復(fù)。2）后適應(yīng)增加了自噬體的形成，恢復(fù)了受損的自噬流，自噬活性升高;nNOS抑制劑L-VNIO削弱了后適應(yīng)這一作用。3）與I/R組相比，IPostC組AMPK磷酸化水平進(jìn)一步增加，mTOR磷酸化水平降低;nNOS抑制劑L-VNIO抑制了后適應(yīng)