長鏈非編碼RNA-HRIM通過自噬通路調(diào)控心肌缺血再灌注損傷的初步研究.pdf

1、背景：冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦切难茏畛Ｒ娂膊?，急性心肌梗死是人類致死的主要原因之一。再灌注治療可以挽救瀕臨死亡的心肌，但同時會導致另一種損傷---缺血再灌注損傷。如何心肌缺血再灌注損傷程度，改善病人的預后已成為當前心血管疾病領域的一個重要課題。缺血再灌注造成心肌細胞損傷的機制尚未完全闡明。一般認為，在心肌缺血再灌注損傷中導致心肌細胞死亡的形式只有凋亡和壞死兩種形式，近年研究證實心肌細胞內(nèi)存在第三種機制調(diào)控心肌細胞的存活或死

2、亡，即自噬作用。它與凋亡類似，通過啟動細胞內(nèi)部信號通路，形成級聯(lián)式信息傳導和相應基因表達，誘導細胞死亡。最近的研究顯示異常表達的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)在多種疾病過程中扮演著重要的角色，這為心肌缺血再灌注機制的研究又增添了一個切入點。
　　目的：分析心肌缺血再灌注過程中差異性表達的lncRNAs，尋找與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的lncRNAs，探討lncRNA調(diào)控心肌缺血再灌注的機制

3、并為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的靶點。
　　方法：
　　第一部分:lncRNAs在心肌缺血再灌注中的差異性表達及目的lncRNAs的挑選利用心肌細胞經(jīng)過缺氧再復氧處理模擬臨床上心肌缺血再灌注損傷后做基因芯片，建立心肌缺血再灌注過程中差異性表達的lncRNAs譜和mRNAs譜（差異倍數(shù)＞1.5倍，P＜0.05）。我們利用一系列的生物信息學分析包括GO分析，Pathway分析針對心肌缺血再灌注損傷的機制確定研究方向，由于ln

4、cRNAs存在多種調(diào)控方式，因此根據(jù)lncRNAs通過調(diào)節(jié)mRNAs的表達發(fā)揮作用，對lncNRA的靶基因進行預測，根據(jù)lncRNAs可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白發(fā)揮相應的作用，我們構(gòu)建lncRNA與mRNA的共表達網(wǎng)絡，從而最終確定目的lncRNAs。
　　第二部分:lncRNAs-HRIM對心肌細胞缺氧再復氧損傷影響的研究構(gòu)建體外心肌細胞缺氧再復氧模型（細胞水平）和langendorff離體心臟缺血再灌注模型（整體水平），采用qRT-

5、PCR檢測目的基因lncRNAs的表達情況。用RNAi技術(shù)對lncRNAs-HRIM進行干擾，觀察lncRNAs對細胞活性的影響，利用Western blot檢測自噬蛋白LC3B的表達，透射電鏡觀察細胞自噬小體的數(shù)目，觀察自噬活性的改變情況以及采用自噬雙標腺病毒(mRFP-GFP-LC3)追蹤自噬流。
　　結(jié)果：
　　第一部分:基因芯片結(jié)果顯示常氧組心肌細胞和缺氧再復氧組心肌細胞之間存在大量差異表達的基因，包括797條lnc

6、RNAs和1898條mRNAs。其中許多與低氧或自噬相關(guān)的分子均高表達。一系列的生物信息學分析包括GO分析、pathway分析、trans/cis靶基因預測以及l(fā)ncRNAs與mRNAs共表達分析提示心肌缺氧再復氧過程與細胞凋亡和自噬有關(guān)，并從中挑取6條表達上調(diào)的lncRNAs(NR_002154;lnc-RNA1，lnc-RNA2，lnc-RNA3，lnc-RNA4，lnc-RNA5)和2條表達下調(diào)的lncRNAs(lnc-RNA6，

7、lnc-RNA7)，并將其中一條表達上調(diào)的lncRNA-NR_002154定義為心肌缺氧再復氧損傷相關(guān)的lncRNA(LncRNAAssociated with Hypoxia Reoxygenation Injury in Myocardial cell,lcnRNA-HRIM)。
　　第二部分:從細胞水平和整體水平，通過qRT-PCR實驗結(jié)果顯示6條lncRNAs(NR_002154; lnc-RNA1，lnc-RNA2，ln

8、c-RNA3，lnc-RNA4，lnc-RNA5)表達發(fā)生下調(diào)和2條lncRNAs(lnc-RNA6，lnc-RNA7)表達發(fā)生下調(diào)，與基因芯片結(jié)果相符。RNAi結(jié)果顯示，在心肌細胞中缺氧再復氧過程中，隨著lncRNA-HRIM的表達的降低，細胞活性明顯增加，自噬的活性下降。
　　結(jié)論：
　　1.心肌在缺氧再復氧過程中具有特異的lncRNAs表達譜。
　　2.lncRNA-HRIM在心肌缺血再灌注損傷中參加自噬通路的調(diào)