TLR-MYD88-NF-B信號通路阻斷對減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用研究.pdf

1、本文內(nèi)容分分為兩部分：
　　第一部分 T細(xì)胞特異性 NF-kB活化抑制較非特異性 NF-kB抑制能更好的減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷
　　目的：研究非特異性 NF-kB抑制劑-UA對減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,并比較 T細(xì)胞特異性 NF-kB活化抑制與非特異性 NF-kB抑制對小鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)影響差異。
　　方法：將雄性 C57BL/6小鼠分為4組,其中一組為 C57BL/6背景 IkB△N-Tg小

2、鼠,每組8只。假手術(shù)組(SO)小鼠接受中線開腹、左側(cè)腎締游離,右腎切除及關(guān)腹操作;溶媒對照組(CMC組)以等體積的CMC灌胃;熊果酸處理組于腎臟缺血前-2,-1,0,1天0.5％羧甲基纖維素(CMC)溶解熊果酸,以10mg/kg灌胃并行中線開腹、左側(cè)腎締游離哈巴狗阻斷60min后開放,右腎切除及關(guān)腹;IkB△N-Tg組同上述操作行IRI。各組通過檢查再灌注損傷后24h,3d,7d檢測各組血清尿素氮(BUN)和肌酐(CR)水平,30天生存

3、率觀察等評價熊果酸對腎臟 IRI的保護(hù)作用。HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化,TUNEL法檢測各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況,MPO免疫組化染色檢測腎臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤,TransFactor比色法檢測各組腎臟組織中NF-kB激活水平,real-time PCR檢測 NF-kB下游炎性因子 IL-1b,IL-6,TNF-a的表達(dá)水平,DCFH-DA熒光探針檢測腎組織中活性氧(ROS)的產(chǎn)生。
　　結(jié)果：與溶媒對照組相比,

4、UA處理組和IkB△N-Tg組24h血清 BUN, Cr水平明顯降低(BUN34.09±4.71612.79±2.194 vs72.63±9.216, p<0.01 p<0.01;sCr60.67±12.6127.33±6.31 vs150.3±14.5,p<0.01 p<0.01)。腎小管上皮細(xì)胞損傷情況較輕,腎小管上皮細(xì)胞凋亡減輕,腎臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤減少,NF-kB激活減輕(0.18±0.050.14±0.02 vs

5、0.36±0.06,p=0.0035 p=0.0005),IL-1b,IL-6,TNF-a表達(dá)下調(diào)(IL-1b1.60±0.151.37±0.15 vs3.80±0.40, p=0.0009,p=0.0006;IL-61.37±0.150.72±0.2 vs3.57±0.65, p=0.0004,p=0.0002;TNF-a1.70±0.100.97±0.58 vs2.40±0.26, p=0.0128,p=0.0008),ROS產(chǎn)生減

6、少(4.6±0.36,4.6±0.50 vs10.07±0.9, p=0.0006,p=0.0008)。UA處理組和IkB△N-Tg組30天生存率結(jié)果顯示將對照組生存率從12.5％分別提高到62.5％和75％.
　　結(jié)論：熊果酸通過抑制NF-kB激活,下調(diào)炎性因子 IL-1b,IL-6,TNF-a的表達(dá),抑制腎臟 IR時 ROS的產(chǎn)生,從而減少炎性細(xì)胞浸潤,減少細(xì)胞的壞死和凋亡,有效保護(hù)小鼠腎臟缺血再灌注損傷,提高生存率。T細(xì)胞特

7、異性 NF-kB抑制較非特異性NF-kB抑制能更好的減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷。
　　第二部分 MyD88抑制聯(lián)合 CD154-CD40T細(xì)胞共刺激信號通路阻斷減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷的實驗研究
　　目的：探討 TLR/MyD88信號抑制聯(lián)合 CD154-CD40T細(xì)胞共刺激信號通路阻斷減輕小鼠腎臟缺血再灌注損傷,并研究其機(jī)制。
　　方法：以雄性 BALB/C小鼠為實驗對象,實驗分為6組:SHAM組,缺血損傷 IRI

8、組,MR1組,TJ-2組,MYD88KO組和TJ-2+MR1聯(lián)合用藥組,功能試驗各組6只,生存率觀察各組8只。TJ-2用藥組于腎臟缺血前-2,-1,0,1天0.5％羧甲基纖維素(CMC)溶解 TJ-2,以100mg/kg腹腔注射并行 IRI,即中線開腹、32℃左側(cè)腎締游離哈巴狗阻斷80min后開放,右腎切除及關(guān)腹。MR1用藥組則于腎臟缺血前-2,-1,0,1天給予0.25mg/次/只,對照組則給予等量的生理鹽水并行上述操作。各組再灌注2

9、4h,3d,7d分別取外周血及左腎。測定血清肌酐(sCr)和尿素氮(BUN)水平。觀察各組生存率。ELISA檢測各組24h炎性因子 IL-1b,IL-6,TNF-a及IL-10水平。EMSA檢測各組24h時點 NF-kB活化水平,DCFH-DA熒光探針檢測腎 IRI后24h ROS產(chǎn)生水平, HE,MPO,TUNEL免疫組化檢測組織病理損傷,炎性細(xì)胞浸潤程度,細(xì)胞壞死凋亡水平。
　　結(jié)果：TJ-2組和TJ-2+MR1組能顯著提高小

10、鼠腎臟嚴(yán)重 IRI后生存率(從12.5％到57.1％和100％)。腎功能結(jié)果顯示兩組小鼠24h血清 BUN分別為47.2±9.5mmol/L,20.4±5.2 mmol/L較 CMC組56.7±8.3mmol/L降低,后者具有統(tǒng)計學(xué)差異 p﹤0.01;血清 Cr分別為102.3±21.6mmol/L,51.2±8.9 mmol/L,對比 CMC組190.6±12.4 mmol/L顯著降低,并具有統(tǒng)計學(xué)差異 p﹤0.05,p﹤0.01。細(xì)

11、胞因子水平 TJ-2組和TJ-2+MR1組對比 CMC組顯著降低 IL-1b(36.23±11.0426.77±7.61 vs97.65±15.06,p﹤0.05,p﹤0.01)IL-6(123.7±19.66103.5±35.99 vs630.3±61.8,p﹤0.01,p﹤0.01)TNF-a(29.57±4.8921.27±8.72 vs114.2±8.27,p﹤0.01,p﹤0.01);但 IL-10表達(dá)水平升高(518.7±5

12、5.01588.5±57.2 vs230.3±61.8, p﹤0.01,p﹤0.01);ROS產(chǎn)生減少(5.16±1.24.17±0.81 vs10.3±2.06,p=0.0205,p=0.0087),NF-kB活化減低。HE病理顯示腎小管細(xì)胞壞死,管型形成,出血等損傷 TJ-2和TJ-2+MR1組相對較輕;且 MPO陽性表達(dá)減少,提示炎性細(xì)胞浸潤減少,TUNEL顯示兩組凋亡細(xì)胞較缺血組顯著減少。
　　結(jié)論：MYD88小分子抑制劑