大鼠腎臟缺血再灌注損傷中性激素對RhoA-ROCK信號通路的影響.pdf

1、目前研究表明.腎臟的缺血再灌注損傷存在性別差異.通常,性別差異最初被解釋為雌激素介導的對病理損傷的保護作用.然而最近研究報道,在缺血再灌注損傷中,雄激素起著比雌激素更為重要的作用.另外,有人提出腎臟的缺血再灌注損傷可能與性激素的平衡狀態(tài)有關.Rho/ROCK信號通路參與心腦血管的缺血再灌注損傷,Rho激酶(Rho-associated kirmse,ROCK)抑制劑能夠改善這種損傷,并且也能改善腎臟缺血再灌注損傷.然而,Rho/ROCK

2、信號通路參與腎臟的缺血再灌注損傷是否存在性別差異;Rho/ROCK信號通路參與腎臟的缺血再灌注損傷是否與性激素平衡狀態(tài)有關仍未得到證實.本研究制備不同性別大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型及不同性激素水平腎臟缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察RhoA/ROCK信號通路參與腎臟缺血再灌注損傷是否存在性別差異;RhoA/ROCK信號通路參與腎臟缺血再灌注損傷是否與性激素及其平衡狀態(tài)有關;ROCK的特異性阻斷劑鹽酸法舒地爾是否能夠阻止腎臟的缺血再灌注損傷,

3、這種阻斷作用是否與性激素平衡狀態(tài)有關.根據(jù)實驗內容我們把實驗分為兩個步驟進行研究:1.RhoA/ROCK信號通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用的性別差異.2.RhoA/ROCK信號通路在不同性激素水平大鼠腎臟缺血再灌注損傷中作用. 方法 1.RhoA/ROCK信號通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用的性別差異應用2.5月齡wistar大鼠建立腎臟缺血再灌注損傷模型(雄鼠:10只;雌鼠:10只).大鼠隨機分為4個實驗組(

4、每組5只).(1)雄鼠假缺血再灌注組(SM);(2)雌鼠假缺血再灌注組(SF);(3)雄鼠缺血再灌注組(IM);(4)雌鼠缺血再灌注組(IF).術前、術后常規(guī)取血檢測血清肌酐(Creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;腎組織石蠟切片常規(guī)病理PAS染色及免疫組化染色,半定量分析腎小管損傷情況,并觀察ROCK活性的特異性分子標記磷酸化膜突蛋白(phosphorylated moesin,p-

5、Moesin)的免疫組化定位及其表達情況;應用逆轉錄酶聯(lián)反應技術(reverse transcription polymerasechainreaction,RT-PCR)檢測腎組織RhoA and ROCK mRNA的表達;應用Westernblot檢測腎組織RhoA蛋白和p-Moesin的表達.2.RhoA/ROCK信號通路在不同性激素水平大鼠腎臟缺血再灌注損傷中作用應用2.5月齡Wistar大鼠建立不同性激素水平大鼠模型(雄性:4

6、0只;雌鼠:30只).大鼠隨機分為7個實驗組(每組10只,每組隨機分為模型組和治療組各5只): (1)正常雄鼠缺血再灌注加安慰劑組(IMV); (2)去勢雄鼠缺血再灌注加丙酸睪丸酮組(CMT);(3)去勢雄鼠缺血再灌注加安慰劑組(CMV);(4)去勢雄鼠缺血再灌注加17 β-雌二醇組(CME);(5)去勢雌鼠缺血再灌注加安慰劑組(OFV);(6)去勢雌鼠缺血再灌注加17 β-雌二醇組(OFE);(7)正常雌鼠缺血再灌注加安慰劑組(IFV

7、).不同性激素水平大鼠模型制備成功后,再建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型.每組隨機選取5只大鼠在缺血再灌注前5分鐘腹腔注射鹽酸法舒地爾.術前、術后常規(guī)取血檢測血清睪酮、雌二醇、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平;腎組織石蠟切片常規(guī)病理PAS染色,半定量分析腎小管損傷情況;應用逆轉錄酶鏈式反應(RT-PCR)技術檢測腎組織內RhoA和ROCK mRNA的表達;應用Western blot檢測腎組織RhoA蛋白和p-Moesin的表達.結果1

8、.RhoA/ROCK信號通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用的性別差異1.1各組大鼠'腎功能分析結果與假手術組相比,手術組大鼠血清BUN和Cr水平顯著升高(p＜0.05);在手術組大鼠中,雄鼠血清BUN和Cr水平顯著高于雌鼠(P<0.05).1.2腎組織形態(tài)學變化與假手術組相比,手術組雄鼠和雌鼠腎臟近曲小管均出現(xiàn)不同程度的缺血壞死(3.8±0.45 vs 0:2.2±0.84 vs 0:p<0.01).在手術組中,雄鼠腎小管損傷明顯重于

9、雌鼠(3.8±0.45 vs 2.2±0.84,P<0.05). 1.3免疫組化結果p-Moesin定位于腎小管上皮細胞胞漿和胞核,腎臟缺血再灌注損傷后p-Moesin表達較假手術組增多(3.4±0.45 vs 1.2±0.55:2.2±0.55 vs 1.4±0.45 vs;P<0.05),并且手術組雄鼠腎小管p-Moesin的表達高于雌鼠(3.4±0.45 vs 2.2±0.55:P<0.05). 1.4 RT-PC

10、R和Western Blot假手術組大鼠腎臟RhoA、ROCK mRNA和RhoA蛋白、p-Moesin的表達在雄鼠和雌鼠之間沒有顯著差異(P>0.05);腎臟缺血再灌注損傷后表達均上調(P<0.05).在手術組中,雄鼠和雌鼠腎臟RhoA、ROCK mRNA的表達沒有顯著差異(P>0.05),而雄鼠腎臟RhoA蛋白、p-Moesin的表達明顯高于雌鼠(P<0.05). 2.RhoA/ROCK信號通路在不同性激素水平大鼠腎臟缺血再

11、灌注損傷中作用2.1各組大鼠血清性激素水平變化情況組內大鼠雌雄激素水平均無明顯差異(P>0.05);去勢后大鼠無論給予17 β-雌二醇還是丙酸睪丸酮,其血清雌二醇和睪酮濃度均升高,但是,其血清的異性激素水平仍低于異性大鼠.雄鼠去勢后血清睪酮濃度下降約10倍,但血清雌二醇水平與對照組沒有明顯差異.雌鼠去勢后血清雌二醇濃度下降了7倍,但血清睪酮水平與對照組沒明顯差異.我們發(fā)現(xiàn)各組之間血清雌二醇和睪酮濃度的比率從IMV組到IFV組(表1)逐漸

12、上升. 2.2血清Cr、BUN濃度和血清性激素水平的關系模型組和治療組血清Cr濃度均與雌/雄激素比率呈明顯的負相關關系(r=-0.834,P<0.05:r=-0.764,P<0.05);模型組和治療組血清BUN濃度與雌/雄激素比率也有一定的相關性(r=-0.693,P<0.05;r=-0.635,P<0.05). 2.3腎組織形態(tài)學變化各缺血再灌注組大鼠腎臟近曲小管均出現(xiàn)不同程度的缺血壞死,并且壞死隨雌/雄激素比率的增加

13、逐漸減輕,鹽酸法舒地爾治療組.腎小管損傷有所改善.各模型組和治療組腎小管損傷評分為:IMV組(3.8±0.45 vs 3.8±0.45)、CMT組(3.6±0.55 vs 3.6±0.89)、CMV組(3.4±0.89 vs 2.8±0.45)、CME組(3.2±0.84 vs 2.6±0.89)、OFV組(2.8±0.45 vs 1.8±0.45)、OFE組(2.6±0.89 vs 1.6±0.55)、IFV組(2.2±0.84 vs

14、 1.2±0.84),在OFV組、OFE組、IFV組中,模型組與相應的治療組之間比較均有顯著差異(p<0.05).2.4 RT-PCR和Western Blot不同性激素水平大鼠腎臟缺血再灌注后,RhoA蛋白、p-Moesin的表達隨血清雌/雄激素比率的增加而逐漸降低;治療組RhoA蛋白和p-Moesin的表達較相應的模型組降低,并且也隨血清雌/雄激素比率的增加而逐漸降低.在OFV組、OFE組、IFV組中,模型組與相應的治療組之間比較均

15、有顯著差異(p<0.05).治療組和模型組RhoA和ROCK mRNA的表達在不同性激素水平腎臟缺血再灌注大鼠之間沒有顯著差異(p>0.05). 結論 1.大鼠腎臟缺血再灌注損傷存在性別差異; 2.RhoA/ROCK信號通路參與大鼠腎臟缺血再灌注損傷存在性別差異; 3.RhoA/ROCK信號通路參與腎臟缺血再灌注損傷與性激素的平衡狀態(tài)有關; 4.性激素平衡狀態(tài)是從蛋白水平而不是基因水平影響RhoA