柚皮苷通過(guò)激活PI3K-AKT-GLUT4信號(hào)通路改善高糖高脂誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗.pdf

1、目的：驗(yàn)證柚皮苷是通過(guò)PI3K/AKT/GLUT4這條信號(hào)通路的作用來(lái)改善胰島素抵抗的。這為胰島素抵抗相關(guān)的疾病治療提供理論基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)，從而為下一步研究疾病的防治策略、治療決策和新藥開(kāi)發(fā)提供有力的證據(jù)。
　　方法：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后，在高糖（葡萄糖）高脂（多種長(zhǎng)鏈脂肪酸混合物，即FFAs）的誘導(dǎo)下，將3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)為胰島素抵抗模型。篩選出柚皮苷最佳劑量和孵育時(shí)間，將不同劑量（0、5μM、1

2、0μM、25μM、50μM、100μM）的柚皮苷分別加入3T3-L1細(xì)胞，將最佳濃度的柚皮苷加入3T3-L1細(xì)胞分別孵育0、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)，篩選出最佳孵育時(shí)間。分別添加抑制劑，將實(shí)驗(yàn)設(shè)為五組：1.正常組；2. IR組；3. IR+柚皮苷組；4. IR+PI3K+柚皮苷組；5. IR+AKT抑制劑+柚皮苷組。在誘導(dǎo)好的胰島素抵抗模型中，依次加入抑制劑LY294002和AKT IV抑制劑，設(shè)置正常對(duì)照組（con

3、trol）。使用油紅O染色檢測(cè)3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)后，觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集情況，確認(rèn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功。提取脂肪細(xì)胞總蛋白，用West ern blo tting法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)AKT、PI3K及其磷酸化蛋白的表達(dá)是否上調(diào)或下調(diào)。
　　結(jié)果：⑴油紅O染色顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ⅰ、Ⅱ的培養(yǎng)下，經(jīng)過(guò)10天，3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成了成熟的脂肪細(xì)胞；⑵在濃度為33mmol/L的葡萄糖、0.5mmol/L的棕櫚酸，24小時(shí)的

4、孵育時(shí)間下，用Western blotting法檢測(cè)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化程度減少，說(shuō)明成功構(gòu)建胰島素抵抗模型。⑶經(jīng)對(duì)劑量和孵育時(shí)間的篩選，柚皮苷的最佳劑量為50μg/ml、最佳孵育時(shí)間為24小時(shí)。⑷加入抑制劑LY294002和AKT IV抑制劑后，用Western blotting法檢測(cè)，與control組相比，柚皮柑組PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)均下調(diào)，有顯著性差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成