PI3K通路介導(dǎo)甲苯二異氰酸酯誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中肺部caspase-1激活和HMGB1產(chǎn)生.pdf

1、目的：
　　提出假設(shè):1.在TDI誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，PI3K信號通路介導(dǎo)肺組織HMGB1的產(chǎn)生。2.NLRP3炎癥體和caspase-1在這個過程中發(fā)揮作用。
　　內(nèi)容：
　　第一部分:根據(jù)TDI哮喘的特點(diǎn)，參考課題組前期造模方式建立TDI誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型;在此模型的基礎(chǔ)之上給予PI3K抑制劑LY294002干預(yù)（腹腔注射），觀察小鼠過敏性氣道炎癥的變化以及小鼠肺組織中HMGB1的變化情況。
　　第二部分:

2、給予PI3K抑制劑LY294002干預(yù)后，觀察TDI哮喘小鼠肺組織中NLRP3炎癥體是否有激活。
　　材料與方法：
　　6周齡的SPF級雄性BALB/c小鼠48只，體重為20-22 g（購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心）。丙酮、橄欖油、TDI、乙酰甲膽堿;LY294002; HE染液，PAS染液;DAB顯色試劑盒。小鼠IgE、白細(xì)胞介素-4(IL-4) ELISA試劑盒。HMGB1一抗、caspase-1、 IL-1β、NLRP

3、3一抗。
　　1.動物模型的制備
　　BALB/c小鼠在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心具有12小時明暗周期的SPF級別動物房飼養(yǎng)，所有實(shí)驗操作嚴(yán)格遵守南方醫(yī)科大學(xué)動物學(xué)科委員會管理規(guī)范。48只小鼠隨機(jī)分為4組:(1) AOO組（即對照組，用AOO致敏、AOO激發(fā)、PBS處理，其中AOO是TDI的溶劑）;(2) TDI組（即實(shí)驗組，用TDI致敏、TDI激發(fā)、PBS處理）;(3) TDI+LY294002組（即PI3K干預(yù)組，用TDI

4、致敏、TDI激發(fā)、LY294002處理）;(4) TDI+DMSO組（用TDI致敏、TDI激發(fā)、DMSO處理，其中DMSO是LY294002的溶劑）。AOO組:第1天、第8天致敏，具體方法:將丙酮和橄欖油的混合液（體積比為2∶3）20微升滴到小鼠耳背部，40 uL/只小鼠;第15天、第18天、第21天給予霧化吸入激發(fā)，具體方法:將小鼠放進(jìn)霧化箱，用移液槍將丙酮橄欖油混合液（體積比為1∶4）放進(jìn)壓縮空氣霧化裝置持續(xù)霧化2小時。每次激發(fā)前1

5、小時按50uL每只的劑量腹腔注射生理鹽水。TDI組:第1天、第8天致敏，具體方法:0.3％TDI20uL（丙酮和橄欖油體積比為2∶3）滴到小鼠耳背部，40uL/只小鼠;第15天、第18天、第21天給予霧化吸入激發(fā)，具體方法:將小鼠放進(jìn)霧化箱，用槍將3％TDI（溶于體積比為1∶4的丙酮和橄欖油混合液）放進(jìn)霧化裝置，持續(xù)霧化2小時。每次激發(fā)前1小時按50uL每只的劑量腹腔注射生理鹽水。TDI+LY294002組操作過程同TDI組，每次激發(fā)前

6、1小時按1.5mg/kg劑量腹腔注射LY294002（LY294002溶于DMSO，用0.9％ NaCl稀釋至50uL）。作為對照，TDI+DMSO組，與TDI+LY294002組操作過程同，每次激發(fā)前1小時腹腔注射等劑量的DMSO(DMSO用0.9％ NaCl稀釋至50uL)。
　　2.氣道高反應(yīng)性檢測
　　小鼠氣道高反應(yīng)性檢測于第3次激發(fā)結(jié)束后24h進(jìn)行，簡要過程如下:將小鼠置于氣壓體積描記儀主倉內(nèi)，用乙酰甲膽堿按遞增濃

7、度（濃度0-10mg/mL）加入霧化器，霧化后乙酰甲膽堿進(jìn)入氣壓體積描記儀主倉，每個濃度霧化后檢測3min，同時觀察小鼠反應(yīng)，BUXCO無創(chuàng)肺功能檢測儀記錄小鼠的氣道反應(yīng)性指標(biāo)Penh(enhanced pause)。
　　3.動物處死和取材
　　小鼠肺功能測量結(jié)束后24h，用致死量的戊巴比妥鈉（100 mg/kg體重）腹腔內(nèi)注射麻醉處死小鼠，給予小鼠眼球摘除，取血，將全血靜置1h后，離心20分鐘，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分，取上清

8、，-80℃保存?zhèn)溆?。將每只小鼠的頸部淋巴結(jié)分離摘除，予氣管插管，用縫線固定導(dǎo)管，行肺泡灌洗術(shù):用0.8mL的預(yù)熱的生理鹽水(0.9％ NaCl，37℃)緩慢、輕柔地注入肺內(nèi)，繼之回抽，重復(fù)3次，最后收集肺泡灌洗液于EP管內(nèi)。然后，將導(dǎo)管插入左肺，往左肺注入4％福爾馬林中性緩沖液0.2mL行內(nèi)固定，摘除左肺，置于4％福爾馬林中性緩沖液進(jìn)行外固定，常溫保存，作以后病理切片備用;摘除右肺-80C保存，作以后免疫印跡備用。
　　4.淋巴細(xì)

9、胞培養(yǎng)及淋巴上清IL-4檢測
　　將上述摘除的各組小鼠頸部淋巴結(jié)分別放入1.5ml EP管，所有EP管均置于冰上，加入1.0mL RPMI-1640。將EP管中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移至40μm細(xì)胞篩上，眼科鑷輕輕擠壓，10mL RPMI-1640沖洗，15mL離心管收集沖洗液，取10uL沖洗液計數(shù)細(xì)胞，剩余沖洗液予1000轉(zhuǎn)/分，離心3分鐘，棄上清液，用RPMI-1640重懸至細(xì)胞濃度為107/ml，準(zhǔn)備48孔板，每孔加入900uL全培養(yǎng)基（

10、RPMI-1640含10％FBS及5 mg/mL刀豆球蛋白A），將100uL的細(xì)胞懸液加入其中使得細(xì)胞濃度為106/mL。放置37℃培養(yǎng)箱43小時。培養(yǎng)結(jié)束后取培養(yǎng)液1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清分裝，放置-80℃保存，用于檢測IL-4。
　　結(jié)果：
　　1.LY294002對TDI誘導(dǎo)的哮喘小鼠PI3K信號通路的影響
　　為確認(rèn)PI3K抑制劑LY294002對PI3K信號通路的作用，我們檢測p-Akt, PI3K最

11、重要的下游分子。我們發(fā)現(xiàn)與AOO組相比，TDI組小鼠在TDI致敏和激發(fā)后，肺組織p-Akt的表達(dá)可顯著上調(diào)(p＜0.05)，而TDI+LY294002組中，LY294002預(yù)處理可顯著減輕TDI誘導(dǎo)的p-Akt表達(dá)上調(diào)(p＜0.05)。TDI+DMSO組p-Akt表達(dá)與TDI組相似，表明LY294002的溶媒DMSO本身并不影響p-Akt表達(dá)(p＞0.05)。
　　2.PI3K介導(dǎo)TDI誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性和過敏性氣道炎癥<

12、br>　　首先，PI3K介導(dǎo)TDI誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性。與AOO相比，在遞增濃度的乙酰甲膽堿(1.25、2.5、5、10mg/mL)刺激后，TDI組小鼠的Penh值顯著增加(p＜0.05)。所有這些改變在LY294002治療后部分恢復(fù)(p＜0.05)。再者，與AOO組相比，TDI組哮喘小鼠血清總IgE的釋放顯著增加(p＜0.05)，以及淋巴細(xì)胞上清培養(yǎng)液的IL-4明顯增加(p＜0.05)，而PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理均可使兩者明

13、顯降低(p＜0.05)。
　　最后，我們評估小鼠肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)，以及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分類計數(shù)。無論是總細(xì)胞數(shù)，還是中性粒細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)，均在TDI刺激后明顯增多(p＜0.05)。肺組織學(xué)檢查顯示出類似的結(jié)果，暴露于TDI的小鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)更多的炎癥細(xì)胞浸潤和顯著的上皮增殖。 LY294002同樣可以部分逆轉(zhuǎn)TDI誘導(dǎo)的BALF和肺組織中的這些改變(p＜0.05)。
　　3.PI3K參與

14、了肺組織HMGB1的生產(chǎn)及其核漿轉(zhuǎn)位
　　免疫印跡結(jié)果示:和上述氣道高反應(yīng)性和過敏性氣道炎癥一致，肺組織HMGB1的蛋白表達(dá)水平在TDI組小鼠比AOO組顯著增高。通過免疫組織化學(xué)染色檢查小鼠肺組織切片也可獲得類似的結(jié)果:在AOO組，HMGB1幾乎只分布在肺組織各種細(xì)胞的細(xì)胞核，然而，3次TDI激發(fā)后，HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞漿，彌漫分布于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、氣道成纖維細(xì)胞和浸潤于肺組織的各種炎癥細(xì)胞。值得注意的是，在

15、PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理后，無論是HMGB1在肺組織的高表達(dá)，還是其核漿轉(zhuǎn)位均在很大程度上得到減輕(p＜0.05)。
　　4.LY294002對肺組織caspase-1激活的影響
　　為進(jìn)一步探討PI3K是通過什么機(jī)制調(diào)節(jié)TDI誘導(dǎo)的過敏性氣道反應(yīng)過程中HMGB1生產(chǎn)和釋放，我們測量HMGB1最為人所公認(rèn)的上游分子caspase-1。首先，使用免疫組織化學(xué)的方法，我們發(fā)現(xiàn)，TDI致敏和激發(fā)后，小鼠肺組織表達(dá)的ca

16、spase-1明顯增多，支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、各種炎癥細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)可見非常濃厚的caspase-1分布，同樣地，LY294002預(yù)處理大大減弱這種TDI誘導(dǎo)的caspase-1上調(diào)。然后，我們通過免疫印跡檢測caspase-1的前體procaspase-1(45KD)和成熟體caspase-1(20KD)在肺組織的蛋白質(zhì)含量，可見:與AOO組相比，TDI組小鼠肺組織成熟體caspase-1(而不是前體procaspase-1)的

17、蛋白質(zhì)水平顯著升高(p＜0.05)。這表明我們通過免疫組織化學(xué)染色觀察到的TDI誘導(dǎo)的caspase-1表達(dá)增加主要是由于成熟體caspase-1構(gòu)成。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這種增加的caspase-1表達(dá)在PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理后明顯逆轉(zhuǎn)(p＜0.05)，而procaspase-1在各組小鼠肺組織的表達(dá)幾乎保持不變(p＞0.05)。這些數(shù)據(jù)表明，TDI誘發(fā)哮喘小鼠中肺組織caspase-1的激活，而PI3K活性是caspase