TLR4-MyD88介導(dǎo)的PI3K-Akt信號(hào)在調(diào)節(jié)小鼠肝臟糖脂代謝中的作用.pdf

1、目的：過(guò)去認(rèn)為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)主要由胰島素抵抗引起的高血糖和高胰島素血癥所致,胰島素信號(hào)通路和葡萄糖信號(hào)通路在調(diào)節(jié)脂肪酸和三酰甘油(TG)合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)過(guò)程起關(guān)鍵作用。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),給予小鼠單劑量Toll樣受體4(TLR4)天然配體細(xì)菌脂多糖(LPS)引起小鼠肝臟脂質(zhì)沉積,但血糖水平不僅未見(jiàn)升高而反而降低。本課題假設(shè):TLR4信號(hào)在調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝過(guò)程也起重要作用。本課題通過(guò)對(duì)比LPS對(duì)TLR4基因突變型小鼠(C

2、3H/HeJ)與TLR4野生型(C3H/HeN和ICR)小鼠肝臟糖脂代謝的不同作用,深入研究TLR4/MyD88介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝的分子機(jī)理。
　　方法：本課題由十個(gè)實(shí)驗(yàn)組成。實(shí)驗(yàn)一、為探討LPS對(duì)小鼠空腹血糖的影響,分別經(jīng)腹腔注射給予C3H/HeJ、C3H/HeN和ICR三種小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS給予后不同時(shí)點(diǎn)(0、2、6、12和24h)檢測(cè)空腹血糖值;實(shí)驗(yàn)二、為探討LPS對(duì)肝臟糖異生相關(guān)

3、基因表達(dá)的影響,經(jīng)腹腔注射給予ICR小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后6h取肝臟,用real-timeRT-PCR檢測(cè)肝臟葡萄糖-6-磷酸酶(g-6-pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepck)mRNA水平;實(shí)驗(yàn)三、為探討LPS對(duì)小鼠糖耐量和胰島素耐受的影響,分別經(jīng)腹腔注射給予C3H/HeJ、C3H/HeN和ICR三種小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后12h進(jìn)行GTT實(shí)驗(yàn)和ITT實(shí)驗(yàn);試驗(yàn)四、為探討LPS對(duì)小鼠肝

4、臟Akt磷酸化水平的影響,分別經(jīng)腹腔注射給予C3H/HeJ、C3H/HeN和ICR三種小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后2、6和12h取肝臟組織,用WesternBlotting檢測(cè)肝臟Akt磷酸化水平;實(shí)驗(yàn)五、為探討LPS對(duì)肝臟胰島素信號(hào)的影響,ICR小鼠隨機(jī)分成4組(對(duì)照組、LPS組、胰島素組和胰島素+LPS組)。LPS處理后6h,胰島素組和胰島素+LPS組給予胰島素(2.0U/kg),5min后取肝臟,用Co-IP檢測(cè)I

5、RS-1酪氨酸磷酸化水平及IRS-1與P85結(jié)合反應(yīng);LPS處理后6h取肝臟組織,用real-timeRT-PCR檢測(cè)肝臟irs-1和irs-2mRNA表達(dá)水平;實(shí)驗(yàn)六、為探討TLR4/MyD88信號(hào)在調(diào)節(jié)肝臟PI3K/Akt信號(hào)中的作用,經(jīng)腹腔注射給予ICR和MyD88-/-小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后2、6和12h收集肝臟,用WesternBlotting檢測(cè)肝臟Akt磷酸化水平,MyD88、P85和PTEN蛋白表達(dá)

6、水平;經(jīng)腹腔注射給予ICR小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后2h取肝臟組織,用Co-IP檢測(cè)MyD88與P85的相互作用;實(shí)驗(yàn)七,為探討LPS是否影響胰島素對(duì)PI3K/Akt信號(hào)的調(diào)節(jié)作用,ICR小鼠隨機(jī)分成4組(對(duì)照組、LPS組、胰島素組和胰島素+LPS組)。LPS處理后6h,胰島素組和胰島素+LPS組給予胰島素(2.0U/kg),5min后取肝臟,用WesternBlotting檢測(cè)肝臟Akt磷酸化水平;實(shí)驗(yàn)八、為探討LP

7、S對(duì)肝臟脂質(zhì)沉積的影響,分別經(jīng)腹腔注射給予C3H/HeJ、C3H/HeN和ICR三種小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后24h取肝臟,用油紅O染色確定肝臟脂質(zhì)沉積;實(shí)驗(yàn)九、為探討LPS對(duì)小鼠肝臟SREBP-1c表達(dá)的影響,分別經(jīng)腹腔注射給予C3H/HeJ、C3H/HeN和ICR三種小鼠LPS(1.0mg/kg),LPS處理后2、6、12h取肝臟組織,用WesternBlotting檢測(cè)肝臟胞核SREBP-1c水平;實(shí)驗(yàn)十、為探討

8、PI3K/Akt信號(hào)通路在LPS誘發(fā)小鼠肝臟SREBP-1c激活中的作用,ICR小鼠隨機(jī)分成4組(對(duì)照組、LY組、LPS組和LPS+LY組)。LPS+LY組于LPS處理前30min經(jīng)腹腔注射LY294002(50mg/kg),LPS處理后12h收集肝臟組織,用WesternBlotting檢測(cè)肝臟磷酸化Akt和核SREBP-1c水平。
　　結(jié)果：本研究結(jié)果如下:(1)LPS引起C3H/HeN和ICR小鼠血糖持續(xù)降低,而C3H/He

9、J小鼠血糖無(wú)明顯變化;(2)LPS顯著下調(diào)g-6-pase和pepckmRNA表達(dá);(3)GTT結(jié)果顯示,LPS處理組C3H/HeN和ICR小鼠葡萄糖耐量降低,而LPS處理組C3H/HeJ小鼠葡萄糖耐量無(wú)明顯變化;ITT結(jié)果顯示,LPS處理組C3H/HeN和ICR小鼠胰島素耐受性增加,而LPS處理組C3H/HeJ小鼠胰島素耐受性無(wú)明顯變化;(4)LPS處理組C3H/HeN和ICR小鼠肝臟Akt磷酸化水平持續(xù)升高,而LPS處理組C3H/H

10、eJ小鼠升高不明顯;(5)LPS對(duì)小鼠肝臟irs-1和irs-2mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化;胰島素引起IRS-1酪氨酸殘基磷酸化水平顯著升高;LPS單獨(dú)對(duì)IRS-1酪氨酸殘基磷酸化水平無(wú)明顯影響,但LPS對(duì)胰島素引起的IRS-1酪氨酸殘基磷酸化有輕度抑制作用;LPS單獨(dú)不促進(jìn)IRS-1與P85結(jié)合,但LPS對(duì)胰島素誘發(fā)IRS-1與P85的結(jié)合也有輕度抑制作用;(6)LPS上調(diào)MyD88表達(dá);LPS促進(jìn)小鼠肝臟MyD88與P85的結(jié)合;LPS

11、對(duì)MyD88-/-小鼠肝臟Akt磷酸化上調(diào)不明顯;(7)LPS與胰島素單獨(dú)處理均可誘發(fā)肝臟Akt磷酸化水平上升,LPS和胰島素聯(lián)合處理對(duì)肝臟Akt磷酸化水平上升有相加作用;(8)LPS誘發(fā)C3H/HeN和ICR小鼠肝臟脂質(zhì)沉積,而LPS處理組C3H/HeJ小鼠肝臟未見(jiàn)明顯脂質(zhì)沉積;(9)LPS顯著升高C3H/HeN和ICR小鼠肝細(xì)胞核SREBP-1c水平,而對(duì)C3H/HeJ小鼠肝細(xì)胞核SREBP-1c水平無(wú)明顯影響;(10)PI3K抑制

12、劑(LY294002)顯著抑制LPS引起的肝臟Akt磷酸化,并抑制肝細(xì)胞核SREBP-1c激活。
　　結(jié)論：本研究得出如下結(jié)論:(1)LPS介導(dǎo)的TLR4信號(hào)參與肝細(xì)胞糖脂代謝的調(diào)控;(2)TLR4激活導(dǎo)致其接頭分子MyD88與PI3K調(diào)節(jié)亞基P85結(jié)合、引起Akt磷酸化,通過(guò)抑制調(diào)控肝臟糖異生關(guān)鍵限速酶基因表達(dá)并抑制肝臟糖異生,繼而引起低血糖;(3)磷酸化Akt參與調(diào)控肝臟脂肪酸和三酰甘油合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c的激活過(guò)