PI3K-Akt和JNK信號通路與AfMNPV誘導斜紋夜蛾SL-1細胞凋亡.pdf

1、細胞凋亡是由胞內基因控制的程序死亡過程，即多細胞生物在生理或病理條件下，經(jīng)過多途徑的信號傳導作用而啟動內部機制，結束其自身生命的過程。目前人們對于細胞凋亡途徑的研究已經(jīng)進行了一個漫長的過程，由于細胞中的信號轉導通路在細胞周期、增殖分化與凋亡以及多種生命活動中的重要調節(jié)作用亦愈來愈受人重視，因此關于細胞凋亡與細胞信號轉導通路間的關系的研究也相繼開展起來。JNK信號轉導通路是MAPK通路的一重要分支，或稱為應激活化蛋白激酶，它在細胞周期、凋

2、亡和細胞應激等多種生理和病理過程中起重要作用;PI3K信號通路通過參與多種細胞生命活動尤其是調節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活而受到人們的重視，其中AKT也稱為蛋白激酶B(PKB)，是PI3K下游主要的效應物，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶或轉錄因子來調節(jié)細胞的功能。
　　關于以上所述的細胞凋亡與細胞信號轉導通路關系的研究基本是在哺乳動物細胞中展開，本實驗室長期從事昆蟲細胞凋亡的研究，前期的實驗已經(jīng)證實了AfMNPV誘導SL-1細胞凋亡

3、的過程中涉及到線粒體凋亡途徑，細胞色素C從胞間質釋放到胞質中后引起下游的一系列復雜的凋亡級聯(lián)反應。本實驗擬在此基礎之上，探究JNK和PI3K-AKT信號通路與AfMNPV誘導SL-1細胞凋亡的過程間是否也存在某種聯(lián)系。
　　SP600125和Wortmannin分別是JNK和PI3K-AKT信號通路的特異性抑制劑，實驗之前我們對實驗細胞SL-1進行了兩種抑制劑的耐受性實驗，發(fā)現(xiàn)SP600125和Wortmannin在濃度低于50μ

4、M時，對SL-1的生長基本無毒害用。首先為了更好地了解SL-1細胞在各種條件下的細胞動力學過程，實驗中采用血細胞板法計數(shù)細胞，繪制它的生長曲線，發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下的SL-1細胞成簡單的“S型”生長，當分別加入這兩種最適濃度的抑制劑SP600125(2.5μM)和Wortmannin(0.5μM)培養(yǎng)細胞后，SL-1的生長趨勢不變，因此后續(xù)實驗中的抑制劑也是采用這兩種濃度。在熒光顯微鏡下從形態(tài)學上定性的觀察DAPI染色的SL-1細胞，發(fā)現(xiàn)

5、經(jīng)SP600125和Wortmannin分別處理的AfMNPV誘導后的SL-1細胞，凋亡小體明顯減少;流式細胞術定量的測量細胞凋亡率的結果與之一致，抑制劑組的細胞凋亡程度明顯較病毒組低，因此初步可以判定JNK和PI3K信號通路參與了AfMNPV誘導SL-1細胞凋亡的過程。
　　接下來研究采用caspase-3酶活的測定以及Western Blot方法檢測凋亡相關蛋白的表達，試圖探究JNK和PI3K-AKT信號通路如何影響AfMNP

6、V誘導SL-1細胞凋亡過程。實驗結果表明，AfMNPV誘導SL-1細胞凋亡后，caspase-3酶活增強且被活化切割成17KD片段，啟動了下游的凋亡事件，但是當分別或同時加入抑制劑SP600125和Wortmannin后，caspase-3的切割大幅度減弱，凋亡程度明顯被抑制，其中同時使用兩種抑制劑的效果和單獨使用抑制劑時區(qū)別不大。于是對凋亡上游事件細胞色素C的變化情況進行檢測，和預測結果一致，在加入抑制劑SP600125和Wortma

7、nnin后胞質中細胞色素C含量顯著下降，這就說明在AfMNPV誘導SL-1細胞凋亡的起始階段，JNK和PI3K信號轉導通路即被活化參與到整個凋亡進程中。
　　在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)編碼JNK的基因jnk1、jnk2、jnk3，其相應的編碼產物JNK1和JNK2廣泛存在于各組織中，當JNK通路被激活，相應的蛋白JNK1和JNK2會發(fā)生磷酸化進而發(fā)揮功能。當用免疫印跡雜交的方法檢測JNK1/2和PI3K的關鍵效應物AKT蛋白的表達情況，

8、發(fā)現(xiàn)AfMNPV是通過磷酸化JNK1/2和AKT來分別激活了JNK和PI3K-AKT信號通路并且影響了SL-1細胞周期，但是所有這些蛋白的磷酸化程度在分別加入SP600125和Wortmannin后相應的減弱。實驗結果顯示無論是被活化切割的caspase-3蛋白還是JNK和PI3K信號通路的效應物P-JNK1/2和P-AKT，蛋白含量都隨病毒誘導凋亡時間的延長而增加。
　　因此初步可以得出結論，JNK和PI3K-AKT信號通路通過