凝血酶激活的血小板促進人外周血CD4+T細胞向Tfh分化.pdf

1、目的:觀察凝血酶激活的血小板對人外周血CD4+T細胞向Tfh分化的影響。
　　方法:
　　1、CD4+T細胞的提取、純度驗證及激活
　　抽取健康青年男性外周血(n=5)，梯度密度離心法提取外周血單個核細胞(PBMC);將提取的PBMC用免疫磁珠方法分選出CD4+T細胞;流式細胞術(shù)鑒定CD4+T細胞分離純度;CD3/CD28聯(lián)合抗體激活分選出的CD4+T細胞;流式細胞術(shù)檢測激活后CD4+T細胞CD69表達。
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2、、血小板的提取及激活
　　抽取健康青年男性外周血(n=5)，二次離心法提取血小板;凝血酶(0.2U/ml，37℃，5min)激活提取的血小板;流式細胞術(shù)檢測激活后血小板CD62P表達。
　　3、血小板與CD4+T細胞共培養(yǎng)
　　分別將激活的CD4+T細胞按照如下分組進行培養(yǎng):A血小板組:激活血小板+CD4+T細胞;B上清組:激活的血小板上清液+CD4+T細胞;C對照組:單純培養(yǎng)基+CD4+T細胞。
　　4、觀察C

3、D4+T細胞形態(tài)變化;共培養(yǎng)72h后收集培養(yǎng)基，ELISA法檢測IL-10表達。分別以CD4、PD-1、CXCR5、FoxP3流式抗體標記共培養(yǎng)后的CD4+T細胞，檢測各組中Tfh（CD4+PD-1+CXCR5+Foxp3-）占CD4+T細胞比例。
　　結(jié)果:
　　1、CD4+T細胞磁珠分選純度鑒定及激活狀態(tài)檢測:流式細胞術(shù)驗證磁珠分選CD4+T細胞純度為（95.93±2.14）％。流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞激活后CD69

4、表達情況，激活組(13.05±2.12)％，明顯高于未激活組（1.48±0.25）％，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　2、血小板激活狀態(tài)檢測:凝血酶(0.2U/ml，37℃，5min)激活血小板后，血小板表面CD62P陽性表達情況為凝血酶組（46.27±2.58）％明顯高于未激活組（10.29±0.44），有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　3、激活后的血小板同激活后的CD4+T細胞共培養(yǎng)后，鏡下觀察，與上清組及對照組相

5、比，血小板組CD4+T細胞表現(xiàn)出明顯的細胞聚集性。
　　4、ELISA法檢測共培養(yǎng)72h后培養(yǎng)基中IL-10的含量，其中血小板組IL-10含量為（60.77±7.59）pg/ml，明顯高于上清組（14.08±2.78）pg/ml及對照組(11.24±2.81) pg/ml，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);而上清組與對照組無統(tǒng)計學差異。
　　5、流式細胞術(shù)檢測CD4+T細胞CD4、PD-1、CXCR5、FoxP3表達情況，其中血