莪術(shù)二酮抑制凝血酶誘導(dǎo)血小板活化的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、血栓是血液成分在血管或者心臟內(nèi)膜表面形成的血液凝塊或沉積物，可以發(fā)生在血液中的任何地方導(dǎo)致血液流動停止。在生理情況下，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞血管壁受到損傷后，血小板隨之附著，導(dǎo)致血小板激活，引起血小板聚集，可發(fā)揮止血作用并且修復(fù)損傷部位。然而，在病理情況下，血小板發(fā)生不正常的或過度的活化可能會在損傷的部位過度聚集進行形成血栓成為心腦血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。由此可見，血栓的形成與血小板活化和聚集密切相關(guān)。
　　現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，從溫郁金中提取的莪術(shù)二酮

2、具有顯著的抗凝血，抗血栓形成的作用。當(dāng)給予四種誘導(dǎo)劑刺激血小板活化時，發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二酮對于凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化具有顯著的抑制作用，那么莪術(shù)二酮抑制血小板激活的作用靶點是什么呢？蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種高通量篩選技術(shù)，已經(jīng)在尋找藥物對疾病的靶點蛋白，比較蛋白功能水平上被廣泛應(yīng)用，而由于血小板無核，病人血小板功能的異常幾乎完全歸因于蛋白表達(dá)的變化翻譯后修飾的動態(tài)差異，而血小板的蛋白組學(xué)只需要少量毫升的血液就能揭示蛋白質(zhì)的翻譯后修飾以及蛋白間的相互作

3、用，而非標(biāo)記定量主要是對酶解后的肽段進行質(zhì)譜分析比較從而對蛋白進行相對定量，于是課題組采用了非標(biāo)記定量的蛋白組學(xué)方法進行了莪術(shù)二酮對凝血酶誘導(dǎo)的血小板激活的抑制作用可能機制的探討。本研究實驗內(nèi)容如下：
　　目的：本研究主要觀察莪術(shù)二酮作用于血小板后蛋白表達(dá)譜的改變情況，探討莪術(shù)二酮抑制血小板活化的可能機制，并找到具體的作用靶點來解釋作用機制。
　　方法：首先采用透射電鏡實驗觀察莪術(shù)二酮對凝血酶誘導(dǎo)的人血小板活化的抑制作用，抽

4、取健康志愿者血小板，洗滌后，分為生理鹽水組，凝血酶誘導(dǎo)組以及莪術(shù)二酮孵育組，數(shù)步處理后觀察不同組別的血小板內(nèi)α顆粒的釋放情況。為進一步闡明莪術(shù)二酮抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的作用機制,本實驗建立了三組血小板蛋白的液質(zhì)分析總離子流圖譜，將Nano ESI-LC-MS/MS得到的數(shù)據(jù)用 Sequest HT引擎搜庫，利用 Proteome Discoverer1.3軟件鑒別各組血小板總蛋白，采用UniProt分析軟件分析蛋白。鑒別后的蛋白利

5、用ChromAlign軟件整合，使用SIEVE1.3軟件鑒別不同組之間的差異蛋白。使用IPA和PANTHER等生物信息學(xué)方法搜索差異蛋白之間的互作網(wǎng)絡(luò)以及參與的信號通路。利用Western blotting方法驗證蛋白組學(xué)結(jié)果以及添加抑制劑來驗證可能的信號通路與作用靶點。
　　結(jié)果：透射電鏡實驗結(jié)果顯示100μM莪術(shù)二酮能夠明顯抑制0.3 U凝血酶引起的血小板內(nèi)α顆粒的釋放。蛋白組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，凝血酶組有22個差異

6、蛋白，其中有8個蛋白上調(diào)，14個蛋白下調(diào)。與凝血酶組相比，莪術(shù)二酮組有兩個差異蛋白，Talin1和β1-tubulin在莪術(shù)二酮處理后顯著下調(diào)。生物信息學(xué)結(jié)果提示差異表達(dá)蛋白質(zhì)與細(xì)胞進程，生物粘附以及生物發(fā)展有關(guān),主要參與了整合素信號通路。Western blotting驗證差異蛋白表達(dá)水平與蛋白組學(xué)結(jié)果相同。抑制β1-tubulin的表達(dá)能夠抑制vinculin/talin1的蛋白表達(dá)水平，同時能夠抑制血小板內(nèi)α顆粒的釋放。