DPPⅣ酶抑制減輕大鼠肺移植缺血再灌注損傷的差異蛋白組學(xué)研究.pdf

1、背景：肺移植（LT）是當(dāng)前治療終末期肺部疾病的唯一有效方法，自1983年第一例成功的臨床異體肺移植完成，二十多年來(lái)，肺移植技術(shù)越來(lái)越多的運(yùn)用于臨床并取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。現(xiàn)全球每年肺移植數(shù)量超過(guò)2000例，截止至2010年，全球158個(gè)中心行各類(lèi)肺移植術(shù)共32652例，平均中位生存期5.3年，五年生存率達(dá)到了52％，十年生存率達(dá)29％。肺移植的生存率隨著各種肺保護(hù)技術(shù)，抗排斥反應(yīng)技術(shù)，及綜合學(xué)科技術(shù)的進(jìn)步逐漸提高。
　　 然而，圍手

2、術(shù)期死亡仍然是造成肺移植失敗的一個(gè)主要因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺移植圍手術(shù)期死亡的主要原因是肺缺血再灌注損傷（I/RInjury）引起的原發(fā)性移植物功能障礙（PGD）。盡管手術(shù)技術(shù)、肺保護(hù)技術(shù)、重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)不斷提高，肺缺血再灌注損傷誘發(fā)的原發(fā)性移植物功能障礙仍然是肺移植早期死亡的主要病因。發(fā)生在移植術(shù)后72小時(shí)內(nèi)的非特異性肺泡及間質(zhì)損傷、肺水腫、低氧血癥是肺缺血再灌注損傷的主要表現(xiàn)。過(guò)去的20年，缺血再灌注損傷的機(jī)制越來(lái)越清楚地被闡明，新型肺保護(hù)

3、液及肺保護(hù)技術(shù)的運(yùn)用使得原發(fā)性移植物功能障礙的發(fā)生率從90年代初的30％降低至目前的12％左右。然而，肺組織相對(duì)于其他實(shí)質(zhì)性臟器有其自有的生理特性，肺組織對(duì)缺血及其他外源性環(huán)境刺激更為敏感，供肺的獲取與保護(hù)較其他實(shí)質(zhì)性臟器更為嚴(yán)格。真正適合作為供肺的來(lái)源的器官數(shù)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于諸如肝，腎，心等實(shí)質(zhì)性臟器。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約3/4的終末期肺部疾病患者在等待合適的供體的過(guò)程中就已死亡，開(kāi)發(fā)新型的具有保護(hù)甚至恢復(fù)作用的肺保存藥物可以減輕移植術(shù)后缺血再灌注

4、損傷的發(fā)生率，并擴(kuò)大供肺的獲取來(lái)源，具有十分重要的臨床意義。
　　 T 淋巴細(xì)胞表面分化抗原CD26/DPPⅣ是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為110kDa的多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，其具有二酰二肽酶活性，并在多種細(xì)胞，如上皮細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等表面表達(dá)，其在肺組織中也發(fā)現(xiàn)了較高的表達(dá)。之前我們的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制供肺二肽酰肽酶Ⅳ（DPPⅣ酶）的活性能夠明顯地減輕大鼠移植肺的I/R 損傷，并在短期內(nèi)（2 h）達(dá)到改善移植肺功能（pulm

5、onary function）的作用。然而抑制供肺DPPⅣ酶活性對(duì)術(shù)后較長(zhǎng)時(shí)間段肺功能的影響以及其減輕移植肺I/R 損傷的具體機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能與CD26/DPPⅣ對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其底物對(duì)肺功能的保護(hù)作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討抑制供肺DPPⅣ酶活性對(duì)大鼠肺移植術(shù)后較長(zhǎng)時(shí)間段肺功能的影響，并運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）技術(shù)找出供肺DPPⅣ酶抑制后肺組織的差異蛋白表達(dá)，探究DPPⅣ酶活性減輕肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷的機(jī)

6、制。
　　 目的：建立大鼠原位異體肺移植模型（rat lung transplantation model），研究供肺DPPⅣ酶活性抑制對(duì)大鼠肺移植術(shù)后較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)(7d)肺功能的影響，并運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)找出供肺DPPⅣ酶抑制后(1d)肺組織的差異蛋白表達(dá)，探究DPPⅣ酶活性抑制減輕肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷的機(jī)制。
　　 方法：以SD 大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，運(yùn)用改良的三套管法建立大鼠原位異體左肺移植模型。運(yùn)用DPPⅣ酶

7、特異性抑制劑AB192 灌注并保存供肺18h后行移植術(shù)，觀察其對(duì)肺移植術(shù)后缺血再灌注損傷及長(zhǎng)期肺功能的影響。將運(yùn)用AB192 灌注保存的進(jìn)行肺組織與對(duì)照組供肺行蛋白組學(xué)研究，即利用雙向凝膠電泳（2D-PAGE）分離兩組總蛋白，通過(guò)圖像分析尋找表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行MALDI-TOF 質(zhì)譜分析。對(duì)經(jīng)質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)ATⅢ應(yīng)用酶聯(lián)免疫法對(duì)其含量進(jìn)行鑒定，研究并驗(yàn)證其對(duì)肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：建立了穩(wěn)定大鼠原位肺

8、移植模型。對(duì)照組大鼠至術(shù)后第7天全部死亡，實(shí)驗(yàn)組（DPPⅣ酶特異性抑制組）的大鼠均存活至術(shù)后第7天。與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組的PIP 值降低，PO2 值升高，W/D 值降低，MPO 活性及MDA 含量降低，并且隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)組的上述指標(biāo)不斷改善，至術(shù)后第7天，各項(xiàng)檢測(cè)值接近正常。運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)找出供肺DPPⅣ酶抑制后肺組織的差異蛋白表達(dá)，比較術(shù)后第1d 兩組供肺組織2D-PAGE 圖譜，得到差異蛋白點(diǎn)87個(gè)。對(duì)其中15個(gè)差異

9、蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜肽質(zhì)量指紋圖分析，鑒定出多個(gè)差異蛋白。其中9個(gè)差異蛋白均在實(shí)驗(yàn)組中過(guò)表達(dá)，而在對(duì)照組組織中低表達(dá)或不表達(dá)，6個(gè)在對(duì)照組中過(guò)表達(dá)。發(fā)現(xiàn)ATⅢ對(duì)肺組織缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：特異性的DPPⅣ酶抑制能夠明顯的減輕大鼠肺移植術(shù)后移植肺的缺血再灌注損傷，并有促進(jìn)肺功能恢復(fù)作用。通過(guò)2-DE 蛋白電泳成功的建立了大鼠肺組織2-DE 圖譜，并發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異蛋白表達(dá)，鑒定了其中15個(gè)蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)了多個(gè)對(duì)肺功能有保護(hù)