外源性一氧化碳通過GELSOLIN介導(dǎo)的PI3K-NADRIN-RAC1通路調(diào)控膿毒癥血小板骨架重構(gòu)的研究.pdf

1、【課題背景】
　　膿毒癥(Sepsis)是一類由感染引起的全身性免疫反應(yīng)綜合征，同時伴有兩個或以上序貫性器官功能障礙（sepsis-related or sequential organ failure assessment SOFA）。在膿毒癥的發(fā)生主要由病原微生物的入侵開始，病原體可產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)，從而導(dǎo)致機體出現(xiàn)過度炎癥反應(yīng)、同時伴有凝血系統(tǒng)、代謝和微循環(huán)功能障礙。血液中LP

2、S不僅可以引起機體的炎癥反應(yīng)，還可以使大量的血小板活化，從而引發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)，進而發(fā)展為膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。因此如何阻止膿毒癥的進展，并改善各靶系統(tǒng)和靶器官的功能是臨床研究的熱點和難點之一。血小板形態(tài)改變和功能密切相關(guān)，而血小板作為凝血系統(tǒng)的重要參與

3、者，在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著非常重要的作用。血小板形態(tài)和功能變化是凝血功能改變的前提，確切了解膿毒癥中血小板形態(tài)和功能改變的機制將有助于尋找潛在的干預(yù)靶點。但目前對于膿毒癥中血小板形態(tài)和功能變化的機制研究尚處在初級階段。
　　研究發(fā)現(xiàn)外源性一氧化碳(Carbon monoxide,CO)具有抑制LPS所引起的血小板的粘附和凝聚的效應(yīng)。磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）是一類

4、磷酸化磷脂酰肌醇及其衍生物的激酶，可以通過激活細胞內(nèi)的鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)換因子(Guanine nucleotide exchange factors,GEFs))和 GTP酶活化蛋白(GTPase activating proteins,GAPs)激活GTP酶(RhoA,Rac1和Cdc42)，從而控制細胞骨架的重構(gòu)。神經(jīng)元發(fā)育調(diào)控蛋白(Neuron-associated developmentally regulated protein

5、,Nadrin)是一類GTP酶活化蛋白(GAPs),它可以通過活化GTP酶(RhoA,Rac1和Cdc42)對血小板肌動蛋白絲(actin filament,AF)的聚合起到調(diào)節(jié)的作用，進而調(diào)控血小板的形態(tài)和功能。凝溶膠蛋白(Gelsolin)是一個肌動蛋白結(jié)合蛋白，在激活的狀態(tài)下和肌動蛋白結(jié)合并對肌動蛋白絲進行剪切和封端；而失活狀態(tài)下的Gelsolin與肌動蛋白絲分離，便于肌動蛋白絲的多聚化。
　　有相關(guān)研究表明，PI3K、Na

6、drin、Rac1及Gelsolin均參與了體細胞的骨架重構(gòu)，且都存在于血小板中。因此從理論上推測，PI3K、Nadrin、Rac1以及Gelsolin參與了膿毒癥血小板的活化。但目前研究僅限于PI3K可促進血小板及其他體細胞的骨架蛋白重構(gòu)，但對于其機制尚無深入研究，且對于外源性CO對血小板骨架蛋白重構(gòu)的影響尚無相關(guān)報道。基于以上研究基礎(chǔ)，本研究主要探討外源性CO通過影響LPS刺激下血小板的PI3K、Nadrin、Rac1以及Gelso

7、lin的活化狀態(tài)調(diào)節(jié)血小板形態(tài)和功能，進而影響膿毒癥中血小板介導(dǎo)的血栓和止血作用。這可能為膿毒癥中抗凝血提供一個解決問題的新思路。
　　【研究目的】
　　本研究旨在研究過PI3K-Nadrin-Rac1-Gelsolin信號通路在膿毒癥血小板骨架重構(gòu)中的作用，并初步探討外源性CO通過PI3K-Nadrin-Rac1-Gelsolin信號通路對膿毒癥中血小板骨架重構(gòu)的影響，并進一步探討外源CO對膿毒癥中的血小板形態(tài)和功能的影響

8、。
　　【研究方法】
　　本研究采用LPS刺激血小板的體外模型模擬膿毒癥中的血小板，觀察LPS對血小板活化（粘附、凝聚和形態(tài)的改變）的誘導(dǎo)作用，并對其采用不同濃度的CORM-2(外源性CO釋放分子)進行干預(yù)，觀察CORM-2對LPS誘導(dǎo)的血小板活化的抑制作用。同時采用熒光分子修飾的鬼筆環(huán)肽標記血小板的肌動蛋白絲，根據(jù)熒光亮度計算血小板的粘附率；用ADP作為誘導(dǎo)劑，檢測血小板的聚集率；采用流式細胞實驗檢測血小板表面粘附因子P-

9、選擇素（P-selectin）的表達量；采用羅丹明偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽標記血小板的肌動蛋白絲，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察、拍照；采用掃描電鏡及原子力顯微鏡觀察血小板表面的形態(tài)和偽足數(shù)量；最后采用Western Blot檢測PI3K、Nadrin、Rac1及Gelsolin的表達。并使用PI3K抑制劑(Wortmannin,LY294002)和Rac1抑制劑(Y27632)對活化血小板進行干預(yù)，再次檢測血小板的粘附率、聚集率、P-選擇素的表達量

10、、肌動蛋白絲的表達量、血小板表面的偽足數(shù)量；及相關(guān)蛋白PI3K、Nadrin、Rac1及Gelsolin的表達，進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　【研究結(jié)果】
　　LPS可以增加血小板的粘附率，而外源性CO可以濃度依賴的方式降低LPS所誘導(dǎo)的血小板的粘附率和聚集率；LPS可以促進血小板表面粘附因子P-選擇素（P-selectin）的表達，而外源性CO則會減少LPS所誘導(dǎo)的P-選擇素的表達量的增加；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果提示：LPS能夠促進

11、血小板中肌動蛋白絲的多聚化，而外源性CO則可以緩解肌動蛋白絲的多聚化；掃描電鏡及原子力顯微鏡結(jié)果提示：LPS刺激下血小板表面的偽足數(shù)量高于對照組，而CORM-2組的血小板偽足數(shù)量有明顯的減少；Western blot結(jié)果表明LPS可以促進血小板內(nèi)Nadrin的磷酸化、Rac1的活化和Gelsolin的磷酸化，而CORM-2可以減少LPS增加的Nadrin的磷酸化、Rac1的活化和 Gelsolin的磷酸化；PI3K抑制劑(Wortman

12、nin, LY294002)也能減少LPS所促進的Nadrin的磷酸化、Rac1的活化和Gelsolin的磷酸化，用Rac1抑制劑(Y27632)也能減緩LPS促進的Gelsolin的磷酸化；同時，PI3K抑制劑(Wortmannin, LY294002)和Rac1抑制劑(Y27632)也能降低LPS誘導(dǎo)的血小板活化后聚集率、粘附率、P選擇素表達量和肌動蛋白表達量，同時減少血小板偽足的生成量。
　　【研究結(jié)論】
　　1.外源

13、性CO可以減緩膿毒癥中血小板的活化(粘附、凝聚和形態(tài)的改變)。
　　2.PI3K-Nadrin-Rac1信號通路介導(dǎo)了膿毒癥中血小板的激活，而外源的CO則可以通過緩解PI3K-Nadrin-Rac1信號通路的激活緩解膿毒癥中血小板的細胞骨架的重構(gòu)。
　　3.gelsolin介導(dǎo)了PI3K-Nadrin-Rac1信號通路調(diào)控的膿毒癥中血小板的活化，而外源性CO也正是通過抑制膿毒癥中g(shù)elsolin的磷酸化而起到緩解血小板細胞骨