外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對膿毒癥中凝血系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用及(部分)分子機(jī)制.pdf

1、膿毒癥(Sepsis)是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中,是機(jī)體對感染的一種全身性炎癥反應(yīng)(SIR),表現(xiàn)為不能控制的炎癥反應(yīng),是嚴(yán)重感染、重度創(chuàng)傷、大手術(shù)后,重型急性胰腺炎和休克等常見的并發(fā)癥。其繼續(xù)發(fā)展則可以導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征(MODS)。膿毒癥時由于炎性細(xì)胞因子的瀑布樣釋放,激活了凝血系統(tǒng),同時纖溶系統(tǒng)及生理性的抗凝系統(tǒng)受到不同程度的抑制,血液處于高凝狀態(tài),微血管內(nèi)微血栓廣泛

2、形成,導(dǎo)致微循環(huán)障礙,膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展為嚴(yán)重膿毒癥及膿毒癥休克。膿毒癥時內(nèi)皮細(xì)胞活化表達(dá)組織因子(tissue factor,TF)增加進(jìn)而激活外源性凝血系統(tǒng)；另外血小板活化、聚集形成病理性血栓,這在炎癥和凝血之間復(fù)雜的相互作用中也占據(jù)著非常重要的中間位置[29、30]。
　　 一氧化碳(carbon monoxide,CO)在機(jī)體內(nèi)由血紅素加氧酶(HO)催化血紅素產(chǎn)生,CO過去曾被認(rèn)為是破壞細(xì)胞呼吸作用的有害物質(zhì)。近年來的研究

3、發(fā)現(xiàn)CO是一種氣體信號分子的,在離體和在體模型中對由內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子具有顯著的抑制作用,我們前期研究也發(fā)現(xiàn)CO可以有效地緩解急性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)出重要的細(xì)胞保護(hù)作用和抗炎效用,但其機(jī)制尚未完全明確。
　　 近來,一種新合成的新型金屬-羰基化合物,一氧化碳釋放分子(tricarbonyldichlororuthenium(Ⅱ)dimer,CORM-2)被證實可以在機(jī)體內(nèi)緩慢釋放CO,擴(kuò)張主動脈,降低心肌缺血再灌注損傷,具

4、有潛在的藥用價值。而目前,有關(guān)外源性CO對膿毒癥高凝狀態(tài)的影響的相關(guān)研究還比較少。為此,在本研究中,我們通過建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)模型及小鼠CLP膿毒癥模型,并用CORM-2干預(yù),進(jìn)行離體和在體實驗研究,旨在探討外源性CO是否對膿毒癥早期高凝狀態(tài)具有抑制作用,并探討CO可能的作用機(jī)制。
　　 第一部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對LPS刺激HUVEC后組織因子(TF)表達(dá)的抑制作用及(部分)分子機(jī)制
　

5、　 目的:1、選用新生兒臍帶作為內(nèi)皮細(xì)胞來源建立HuVEC模型并驗證；2、建立HUVEC膿毒癥模型并確定最佳LPS刺激濃度；3、確定CORM-2的最佳實驗濃度；4、檢測CORM-2對LPS誘導(dǎo)HUVEC后TF及NF-κB活性的影響。
　　 方法： HUVEC來源于64小時內(nèi)新生胎兒臍帶,宜在37℃,含5％CO2、95％濕度的環(huán)境中培養(yǎng),采用M199培養(yǎng)基,定期換液,6-8天細(xì)胞生長達(dá)融合后用胰蛋白酶消化,按1:3的比例傳代。觀

6、察HUVEC的形態(tài),檢驗細(xì)胞內(nèi)ⅤⅢ因子相關(guān)抗原表達(dá)。再取傳代后生長達(dá)到融合的HUVEC,棄去細(xì)胞培養(yǎng)基,加入1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml不同濃度LPS對HUVEC進(jìn)行刺激,培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h,觀察炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的變化,選定最適LPS濃度。運(yùn)用10μM、50μM、100μM、200μM不同濃度的CORM-2與HUVEC共孵育4h,培養(yǎng)箱條件均為37℃、5％CO2和95％相對濕度,觀察CORM-2的細(xì)胞毒性和確定實驗濃

7、度。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及凝膠電泳遷移率改變分析法(EMSA)檢測CORM-2應(yīng)用前后HUVEC膿毒癥模型TF活性、含量及NF-κB表達(dá)的情況。
　　 結(jié)果：本實驗室成功建立了HUVEC模型,模型細(xì)胞生長融合后呈典型的鋪路石狀排列,細(xì)胞內(nèi)ⅤⅢ因子相關(guān)抗原陽性率達(dá)95％。HUVEC膿毒癥模型取10μg/ml LPS為最適濃度,建立過程規(guī)范,損傷后PMN粘附率明顯增高,NO、ROS活性明顯增加,iNOS、ICAM-1、HO

8、-1蛋白的表達(dá)明顯增加,NF-κB活性也顯著增高。10μM、50μM、100μM濃度對HUVEC進(jìn)行刺激效果較好,相比LPS組,CORM-2與LPS共同處理組對TF及NF-κB表達(dá)有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：本實驗室培養(yǎng)的HUVEC及相應(yīng)的膿毒癥模型符合實驗要求,可以用于體外實驗。HUVEC的膿毒癥模型可以用于在細(xì)胞水平研究炎癥的反應(yīng)機(jī)制,各種炎癥因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子等都發(fā)生了相應(yīng)的變化。本課題研究表明,外源性CO不但可

9、以抑制炎癥反應(yīng),對TF及NF-κB表達(dá)辦有明顯的抑制作用。這一結(jié)果表明,外源性CO可以通過干預(yù)外源性凝血途徑來抑制膿毒癥的發(fā)展,對于臨床危重病人的救治具有十分重要的意義。
　　 第二部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對CLP小鼠TF的抑制作用及(部分)分子機(jī)制
　　 目的:為了探討機(jī)體膿毒癥時的凝血系統(tǒng)的變化,我們建立了CLP小鼠的在體模型,并通過檢測小鼠膿毒癥后肝臟炎癥反應(yīng)程度,確保CLP模型建立的質(zhì)量,并進(jìn)一步

10、明確嚴(yán)重膿毒癥小鼠血液中TF與HUVEC膿毒癥模型中TF表達(dá)的關(guān)系,同時重點(diǎn)探討外源性CO對機(jī)體嚴(yán)重膿毒癥后外源性凝血途徑的抑制作用及部分分子機(jī)制。
　　 方法：6-8w大小的小鼠正常飼養(yǎng)1W后,2％異氟烷麻醉進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿刺法建立小鼠膿毒癥模型,經(jīng)病理檢測和生命體征、細(xì)胞因子、黏附分子、轉(zhuǎn)錄因子及參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的多種酶等指標(biāo)確定模型的標(biāo)準(zhǔn)化。小鼠在CLP后立即靜脈注射CORM-2(8.0mg/kg)(加入在1521μl

11、生理鹽水中),以假手術(shù)組小鼠為對照組。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測CORM-2應(yīng)用前后各時間段膿毒癥小鼠血漿中TF、TFPI含量表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：小鼠膿毒癥模型的建立過程規(guī)范,操作簡單,且模型的檢測指標(biāo)明確。CLP術(shù)后24h小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂；肝功能損害較重,血清中ALT含量升高；多種細(xì)胞因子及粘附分子表達(dá)明顯增加,AP-1、NF-κB蛋白表達(dá)明顯增加,膿毒癥模型達(dá)到了實驗要求。外源性凝血系統(tǒng)啟動

12、因子TF表達(dá)亦明顯增加而TFPI表達(dá)則減低。予CORM-2抑制炎癥反應(yīng)發(fā)展的同時,可抑制TF、促進(jìn)TFPI的表達(dá)。
　　 結(jié)論：本CLP小鼠膿毒癥模型在機(jī)體損傷,肝臟損傷方面達(dá)到了預(yù)期的要求。本課題研究顯示,外源性CO的干預(yù)能明顯抑制外源性凝血系統(tǒng)啟動因子TF表達(dá),同時促進(jìn)TF的拮抗因子TFPI的表達(dá)。因NF-κB可介導(dǎo)多種炎癥因子及TF的基因轉(zhuǎn)錄,而CORM-2可以抑制NF-κB蛋白表達(dá)這在第一部分的離體研究中已闡述,這一結(jié)果

13、提示外源性CO至少部分是通過抑制NF-κB的活性來干預(yù)外源性凝血系統(tǒng)的啟動。
　　 目的:1、檢測高濃度氧與CORM-2聯(lián)合干預(yù)下CLP小鼠凝血因子的變化；2、探討高氧與CORM-2聯(lián)合干預(yù)下CLP小鼠血小板膜糖蛋白及血小板功能指標(biāo)的變化。
　　 方法：先使小鼠處于純氧環(huán)境中0.5小時作為預(yù)處理,再行CLP處理及CORM-2干預(yù)。對不同時間段處理組小鼠先以雙波長吸光度比值法檢測血液中碳氧血紅蛋白濃度(HBCO％),并計算

14、其存活率；再取全血檢測凝血因子FIB、D-D水平；分離富血小板血漿(PRP),用流式細(xì)胞儀分析PRP中血小板膜糖蛋白CD41、CD61、CD62-p水平,以檢測膿毒癥時血小板活化程度；最后取抗凝血,用玻球法分析血小板粘附率,用血小板聚集儀分析血小板聚集功能的變化,并制出聚集率曲線圖,從功能上分析高氧聯(lián)合CORM-2對CLP小鼠血小板的作用。
　　 結(jié)果：高氧聯(lián)合CORM-2干預(yù) CLP膿毒癥小鼠后可以明顯降低血液中HBCO的含量

15、,并有效提高CLP小鼠的存活率；聯(lián)合干預(yù)亦可降低凝血因子FIB、D-D的表達(dá):同時降低血漿中血小板膜糖蛋白CD61、CD62p(CD41變化不太明顯),對活化后血小板粘附和聚集功能的亢進(jìn)也有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：本研究采用高氧聯(lián)合CORM-2對CLP小鼠進(jìn)行干預(yù),比單用CORM-2能更好地發(fā)揮外源性CO的作用。同時,從凝血因子、血小板活化及其功能指標(biāo)的檢測上也顯示了高氧聯(lián)合CORM-2可以在一定程度上抑制膿毒癥時凝血系統(tǒng)