外源性一氧化碳釋放分子（CORM）2預處理對膿毒癥早期炎癥反應的抑制作用及分子機制.pdf

1、膿毒癥(Sepsis)是指各種致病微生物或其毒素存在于血液或組織中，是機體對感染的一種全身性炎癥反應(SIR)，表現(xiàn)為不能控制的炎癥反應，膿毒癥和SIRS在性質和臨床表現(xiàn)上基本是一致的，只是病因不同而已。炎癥反應是感染或非感染因素如細菌感染、外傷、燒傷、較大外科手術等，刺激宿主免疫系統(tǒng)，釋放細胞炎癥介質，發(fā)生的一種臨床病理過程。以細胞因子為代表的多種炎癥介質的失控性釋放，產(chǎn)生過度炎癥反應，不僅不能去除機體的致病因素，反而會抑制免疫系統(tǒng)。

2、其繼續(xù)發(fā)展則可以導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)、膿毒癥和多器官功能不全。其共同病理生理特征是自身的免疫失控、體內(nèi)白細胞大量激活，產(chǎn)生過量的炎癥介質而引起全身多個臟器損傷。 一氧化碳(carbon monoxide，CO)在機體內(nèi)由血紅素加氧酶(HO)催化血紅素產(chǎn)生，CO過去曾被認為是破壞細胞呼吸作用的有害物質。最近的研究發(fā)現(xiàn)CO是一種氣體信號分子的，在損傷誘導的各種機體應激中具有保護組織的作用，并且CO在心血管、神經(jīng)和免疫的

3、生理和病理過程中都起著重要的調節(jié)作用。我們研究發(fā)現(xiàn)CO對炎癥反應也具有抑制作用，但其機制尚未明確。 在本研究中，我們利用可以在機體內(nèi)釋放CO的一種新型金屬一羰基化合物，一氧化碳釋放分子(tricarbonyldichlororuthenium(II)dimer， CORM-2)，通過體外預處理和在體實驗研究是否外源性CO對炎癥反應具有抑制作用及其有效濃度范圍，并且探討CO的作用機制。 第一部分HUVEC模型的建立及驗證目

4、的血管內(nèi)皮細胞(VEC)是機體中一類重要的細胞群體，在體內(nèi)廣泛分布形成血液和組織之間的界面，構成機體的天然免疫屏障，具有重要的分泌、合成、代謝和免疫功能。由于新生兒臍帶方便、易取，而且是同種細胞，排異性小，通過擴增可獲得大量的內(nèi)皮細胞，因此，我們采用HUVEC進行炎癥機制的研究。在各實驗室中， HUVEC培養(yǎng)條件也各異。本實驗即為了創(chuàng)建本實驗室HUVEC標準化模型并對此模型進行驗證而進行了詳細的研究。 方法人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Hu

5、man umbilical vein endothelial cell，HUVEC)來源于6小時內(nèi)新生胎兒臍帶，宜在37℃，含5％CO2、95％濕度的環(huán)境中培養(yǎng)，采用M199培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中應含20％熱滅活的小牛血清，10IU/ml肝素，抗生素(1001U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)，1.51xg/ml兩性霉素B和80ug/ml內(nèi)皮促有絲分裂劑，在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2d換液1次，6-8天后細胞

6、生長達融合。用1ml 0.25％胰蛋白酶和0.025％EDTA混合液(V=l/1)在37℃條件下消化，按1:3的比例傳代。觀察HUVEC的形態(tài)，并且需要對細胞形態(tài)、細胞內(nèi)VIII因子相關抗原表達進行檢驗。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝片，運用免疫組化法檢測細胞內(nèi)VIII因子相關抗原的表達。 結果本實驗室成功建立了HUVEC模型，實驗細胞生長良好；經(jīng)驗證，該模型細胞生長融合后呈典型的鋪路石狀排列，細胞內(nèi)VIII因子相關抗原陽性率達9

7、5％，綠色的顆粒均勻地分布在整個細胞漿內(nèi)。 結論本實驗室培養(yǎng)的HuVEC在細胞形態(tài)、生長情況和特異性分泌抗原上符合實驗要求。實驗條件穩(wěn)定易控，因而在本實驗室條件下生長的HUVEC模型可以用于體外實驗。 第二部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2預處理對LPS誘導HUVEC的炎癥反應的抑制作用及分子機制目的為了探討機體膿毒癥時的炎癥反應機制，我們采用LPS對HUVEC進行刺激建立細胞膿毒癥模型，在離體方面研究炎癥反應的機

8、制。CO是一種可擴散性氣體信息分子，具有細胞保護作用，抗氧化的功能及抗炎作用。但是外源性CO抗炎作用的機制并未有明確的研究，為了評價CORM釋放的CO對LPS誘導的內(nèi)皮細胞活性的作用及潛在的機制，本課題也將進一步進行闡明。 方法取傳代后生長達到融合的HUVEC，棄去細胞培養(yǎng)基，加入10ug/ml的LPS孵育液200ul，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，空白對照組加入200uL M199液后也置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件均為37℃、5％CO2和

9、95％相對濕度。運用50UM、100uM劑量的CORM-2對HUVEC預處理2h，再進行LPS刺激4h，或者與LPS共同培養(yǎng)4h后，觀察炎癥反應過程當中，多種細胞因子、黏附分子、轉錄因子，以及參與炎癥反應放大與延續(xù)的多種酶的變化。 結果HUVEC膿毒癥模型的建立過程規(guī)范，各種條件易于控制，且模型的檢測指標明確：損傷后PMN粘附率明顯增高，NO、ROS活性明顯增加，iNOS、ICAM-1、HO-l蛋白的表達明顯增加，NF-KB活性

10、也顯著增高。相比與LPS共同培養(yǎng)，CORM-2的預處理對于炎癥反應具有更加明顯的抑制作用。 結論對膿毒癥臨床研究發(fā)現(xiàn)，阻斷炎癥介質的作用或應用LPS單克隆抗體效果并不明顯。因此，闡明LPS激活內(nèi)皮細胞的分子調控機制顯得十分必要。HUvEC的膿毒癥模型可以用于在細胞水平研究炎癥的反應機制，各種炎癥因子、黏附分子、轉錄因子等都發(fā)生了相應的變化。本課題顯示，外源性CO的預處理及干預都能抑制炎癥的反應，其中外源性CO預處理的作用較大。這

11、一結果，對于臨床危重病人的救治具有十分重要的意義。 第三部分外源性一氧化碳釋放分子(CORM)2對CLP肝臟小鼠炎癥反應的抑制作用及分子機制目的為明確機體在嚴重創(chuàng)傷情況下炎癥反應的機制，我們制作了CLP小鼠的在體模型，并利用此模型研究在嚴重創(chuàng)傷后肝臟炎癥反應，進一步明確嚴重膿毒癥小鼠損傷后炎性反應與HUVEC膿毒癥模型時炎性反應的關系，同時重點探討外源性CO對機體嚴重膿毒癥后炎癥反應的抑制作用及分子機制。 方法6.8w大

12、小的小鼠正常飼養(yǎng)1W后，2％異氟烷麻醉進行盲腸結扎穿刺法建立小鼠膿毒癥模型，經(jīng)病理檢測和生命體征、細胞因子、黏附分子、轉錄因子及參與炎癥反應放大與延續(xù)的多種酶等指標確定模型的標準化。小鼠在CLP后立即靜脈注射CORM-2(8.0mg/kg)，加入在152ul生理鹽水中，以正常小鼠為對照組。測定CLP 24小時后肝功能，肝臟ICAM-l、Nf-kB和AP-1活性的表達。 結果小鼠膿毒癥模型的建立過程規(guī)范，操作簡單，具有可重復性，且

13、模型的檢測指標明確。CLP術后24h小鼠肝臟微血管通透性明顯增高，肝細胞明顯腫脹，胞漿疏松，肝小葉結構紊亂，竇腔內(nèi)有中性粒細胞聚集，門脈區(qū)有較多中性粒細胞浸潤；肝功能損害較重，血清中ALT含量升高；血清細胞因子TNF-a、IL-1B表達明顯增加，肝組織ICAM-l的表達明顯增加，AP-l、NF-kB蛋自表達明顯增加。外源性CO的直接干預可以明顯抑制炎性反應，保護細胞。 結論本膿毒癥模型在機體損傷，肝臟的損傷方面達到了預期的要求。