一氧化碳釋放分子對人牙周膜成纖維細胞炎性反應的影響及其機制.pdf

1、目的：
　　本課題組在前期研究中已發(fā)現(xiàn)，作為外源性CO的供源，CORM-3應用于炎癥因子誘導的人牙齦成纖維(HGF)細胞時能夠抑制其黏附分子的表達，抑制免疫活性細胞向牙周組織黏附、浸潤和深部遷移，從而減輕宿主的炎性病理反應。前期研究結果提示我們CORM-3的應用可為牙周病的治療提供了一種極具潛力的方法?；谝陨涎芯勘尘?，我們以人牙周膜成纖維細胞作為體外實驗模型，以LPS和尼古丁共同刺激來模擬吸煙的牙周炎患者的牙周組織局部微環(huán)境，研

2、究CORM-3對人牙周膜成纖維細胞的毒性、增殖和凋亡的影響，以及在炎性環(huán)境中對牙周膜成纖維細胞炎性因子和破骨細胞因子表達的調控作用，同時探討HO-1通路是否參與CORM-3對上述因子表達的調控。
　　方法：
　　第一部分 CORM-3對人牙周膜成纖維細胞的毒性、增殖和炎癥環(huán)境下抑制細胞凋亡的影響
　　取新鮮拔除的恒牙，用組織塊法分離并培養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細胞，鑒定細胞來源，取狀態(tài)良好的第4～6代細胞用于各項試驗。采用

3、細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)測定不同濃度(0、100、200、400、800μM)CORM-3對HPDLF細胞的毒性作用;以濃度為0、100、200、400μM的CORM-3刺激細胞，分別于0，24，48，72，96小時用CCK-8法檢測細胞活性，評價CORM-3對HPDLF細胞增值的影響。
　　建立LPS和尼古丁刺激下HPDLF細胞炎癥模型，采用Annexin V-FITC/PⅠ雙染法、應

4、用流式細胞術檢測工作濃度的CORM-3是否抑制炎癥環(huán)境下HPDLF細胞凋亡。
　　第二部分 CORM-3抑制LPS和尼古丁誘導的人牙周膜成纖維細胞炎癥因子及破骨細胞因子表達的作用及其機制
　　（一）CORM-3對LPS和尼古丁誘導的人牙周膜成纖維細胞炎癥因子和破骨分化因子的影響
　　取新鮮拔除的恒牙，分離并培養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細胞，鑒定細胞來源后取狀態(tài)良好的第4～6代細胞用于實驗。常規(guī)培養(yǎng)細胞并以濃度為400μMCO

5、RM-3預處理細胞6h，然后以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激24h，用常規(guī)Trizol的方法提取細胞總RNA，應用實時定量PCR的方法從基因水平檢測炎癥環(huán)境下人牙周膜成纖維細胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的mRNA表達以及CORM-3的調控作用;同樣在CORM-3預處理6h，然后以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁炎癥誘導24h后，收集HPDLF細胞提取總蛋白，用蛋白印記實驗方法在蛋白水平檢測炎癥環(huán)境下人牙

6、周膜成纖維細胞COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表達以及CORM-3的調控作用。用完全釋放掉CO的失活的CORM-3預處理人牙周膜成纖維細胞后再以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁誘導致炎，觀察CORM-3對COX-2、PGE2、OPG和RANKL表達的調控作用是否還存在，以確定CORM-3的抑炎作用是否由其活性成分CO介導。
　?。ǘ〤ORM-3對人牙周膜成纖維細胞HO-1表達的影響
　　取新鮮拔除的恒牙

7、，分離并培養(yǎng)原代牙周膜成纖維細胞，鑒定細胞來源后取狀態(tài)良好的第4～6代細胞用于實驗。以濃度為400μM CORM-3預處理細胞6小時后，分別提取細胞總RNA和總蛋白，以實時定量PCR和蛋白印跡實驗的方法，從mRNA和蛋白水平檢測HO-1的表達。用完全釋放掉CO的失活的CORM-3預處理人牙周膜成纖維細胞6小時，分別提取細胞總RNA和總蛋白，以實時定量PCR和蛋白印跡實驗的方法，從mRNA和蛋白水平檢測HO-1的表達。探討該作用是否由CO

8、RM-3的活性成分CO介導。
　　常規(guī)培養(yǎng)細胞并以400μM的CORM-3預處理細胞6小時，以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁誘導致炎，24小時后分別提取細胞總RNA和總蛋白，以實時定量PCR和蛋白印跡實驗的方法，從mRNA和蛋白水平檢測HO-1的表達。用完全釋放掉CO的失活的CORM-3預處理人牙周膜成纖維細胞6小時，以濃度為1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁誘導致炎，24小時后用上述方法檢測HO-1的表達，以確定C

9、ORM增強HO-1表達作用是否由CO介導。
　?。ㄈ〤ORM-3抑制LPS和尼古丁誘導的人牙周膜成纖維細胞炎癥因子及破骨細胞因子表達的機制
　　取新鮮拔除的恒牙，分離并培養(yǎng)原代牙周膜成纖維細胞，鑒定細胞來源后取狀態(tài)良好的第4～6代細胞用于實驗。研究CORM-3的抑炎作用是否由機體細胞保護機制HO-1通路介導。采用LIP03000用瞬時轉染的方法將HO-1基因沉默，以濃度為400μM的CORM-3預處理人牙周膜成纖維細胞6小

10、時，以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細胞24小時，分別提取RNA和總蛋白，以實時定量PCR和蛋白印跡法從基因和蛋白產(chǎn)物兩方面檢測HO-1、COX-2、PGE2、OPG和RANKL的表達，研究在缺失HO-1通路的介導作用后，CORM-3對炎癥細胞因子和破骨分化相關因子的調控作用是否存在。
　　結果：
　　第一部分 CORM-3對人牙周膜成纖維細胞的毒性、增殖的影響以及抑制炎癥環(huán)境下細胞凋亡的作用
　　成功分離培

11、養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細胞，鑒定為中胚層來源。CCK-8檢測結果濃度為0～400μM的CORM-3刺激人牙周膜成纖維細胞24小時后，細胞的數(shù)量以及形態(tài)與正常對照組比較無明顯差異，檢測細胞活性示與對照組無明顯差異，提示該濃度范圍的CORM-3對人牙周膜成纖維細胞無明顯毒性，而800μM的CORM-3對人HPDLF細胞則有明顯毒性。以0、100、200、400μM的CORM-3刺激HPDLF細胞，分別于0，24，48，72，96小時用CCK-

12、8法檢測細胞活性，結果顯示濃度為400μM的CORM-3對HPDLF細胞有較明顯的促增殖作用。1μg/ml的LPS和5mM尼古丁可促進HPDLF細胞的凋亡，以工作濃度400μM的CORM-3預處理后，則可抑制炎癥刺激引起的細胞凋亡。
　　第二部分 CORM-3對人牙周膜成纖維細胞炎性因子及破骨細胞因子表達的影響及其作用機制
　?。ㄒ唬〤ORM-3對LPS和尼古丁誘導下的人牙周膜成纖維細胞炎癥反應的調控作用
　　以1μg

13、/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細胞，炎性細胞因子COX-2、PGE2、RANKL的表達量較對照組均顯著升高(P＜0.05)，且骨保護素OPG的表達受到明顯抑制。以400μM CORM-3預處理細胞6小時，再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激細胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表達較致炎組均顯著降低(P＜0.05)，而OPG則有明顯提高(P＜0.05)。而完全釋放掉CO的失活的CORM-3則無明顯抑炎作用。證明CO

14、RM-3有抑制LPS和尼古丁誘導的HPDLF細胞炎癥的作用而且該作用是由CORM-3溶于液體后釋放出的CO介導而不是由其底物。
　?。ǘ〤ORM-3對人牙周膜成纖維細胞HO-1表達的影響
　　單獨以濃度為400μM CORM-3預處理細胞6小時后，HO-1的mRNA和蛋白表達較對照組比較有顯著提高(P＜0.01);而完全釋放掉CO的失活的CORM-3則無提高HO-1表達的作用，表明CORM-3有促進HPDLF細胞HO-1高

15、表達的作用，而且該作用由CORM-3的活性成分CO介導的。
　　以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細胞，HO-1的表達較對照組有所升高(P＜0.05);以濃度為400μM的CORM-3預處理細胞6小時后，再以1μg/ml的LPS和5mM的尼古丁刺激細胞，則HO-1的表達較對照組和致炎組均有顯著升高(P＜0.01);而完全釋放掉CO的失活的CORM-3預處理細胞則無提高HO-1表達的作用。提示1μg/ml LPS+5mM尼古

16、丁的傷害性刺激能提高HO-1的表達量，而以400μM CORM-3預刺激后再致炎，則有更顯著的促進HO-1高表達的作用。
　　(三)CORM-3對LPS和尼古丁誘導下的人牙周膜成纖維細胞的抑炎作用的機制
　　采用瞬時轉染的方法將HO-1基因沉默后，以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激細胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表達較對照組均顯著升高(P＜0.05)，但骨保護素OPG的表達無明顯改變;HO-1基因沉默

17、后，以400μM CORM-3預處理細胞6小時，再以1μg/ml LPS和5mM尼古丁刺激細胞，其炎性因子COX-2、PGE2、RANKL的表達較對照組顯著升高(P＜0.05)，而且與致炎組比較無明顯變化，雖OPG的表達無明顯改變，但OPG/RANKL比值顯著降低(P＜0.05)。結果顯示在HO-1通路缺失的情況下，CORM-3抑制炎性因子及破骨細胞因子表達的作用消失，提示我們CORM-3對LPS和尼古丁誘導下的HPDLF細胞的抑炎作用

18、是通過HO-1通路介導的。
　　結論：
　　1.400μM CORM-3對人牙周膜成纖維細胞無明顯毒性，且有促進增殖作用，400μM CORM-3抑制IPS和尼古丁誘導的HPDLF細胞凋亡。
　　2.400μM CORM-3抑制脂多糖和尼古丁刺激下人牙周膜成纖維細胞炎性因子及破骨細胞因子表達。
　　3.400μM CORM-3能顯著增強人牙周膜成纖維細胞HO-1的表達。
　　4.CORM-3抑制脂多糖和尼古