血清素對巨核細(xì)胞形成前血小板、細(xì)胞骨架重構(gòu)的影響.pdf

1、背景與目的:在出血性疾病中,血小板減少癥是一個臨床常見問題,其原因有腫瘤放、化療及造血干細(xì)胞移植后骨髓抑制,化療藥物損傷巨核細(xì)胞本身,以及遺傳性、免疫性疾病如 MYH9相關(guān)性疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等。目前治療血小板減少癥的主要措施是血小板輸注,但反復(fù)血小板輸注,有輸血反應(yīng)或同種免疫的風(fēng)險,甚至誘生抗血小板抗體而導(dǎo)致輸注無效。如何迅速提高血小板數(shù)目及質(zhì)量又避免抗體產(chǎn)生等不良作用已成為目前臨床亟待解決的問題。近年來相繼發(fā)現(xiàn)了粒細(xì)胞集落

2、刺激因子、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素等細(xì)胞因子,較好的解決了粒細(xì)胞缺乏和貧血等問題,也為血小板減少癥的治療開辟了新的思路。1994年成功分離的促血小板生成素是目前臨床用于提升血小板的藥物之一,但其臨床應(yīng)用時間較短,且單獨使用 TPO并不能較快的有效治療血小板減少癥,更因其不可預(yù)測的副作用,如:TPO抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致的嚴(yán)重出血,限制了TPO在臨床應(yīng)用前景。開發(fā)能直接、迅速促進血小板生成、釋放的藥物已經(jīng)成為了臨床的迫切需要。<

3、br>　　在巨核細(xì)胞形成前血小板和血小板釋放的終末調(diào)節(jié)階段,細(xì)胞骨架重組起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞骨架由微管、微絲及中間纖維組成,是巨核細(xì)胞前血小板生成和血小板釋放的動力,微管促進前血小板延伸,微絲促進前血小板分支、擴增,微管抑制劑 nocodazole和微絲抑制劑細(xì)胞松弛素B或D能阻斷前血小板的形成。
　　血清素是一種吲哚胺,除了作為神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì),在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及外周器官起著重要的生理功能之外,也是巨核細(xì)胞造血的一個選擇

4、性生長因子。5-HT能通過作用于巨核細(xì)胞表面的5-HT2R促進巨核細(xì)胞增殖、分化。另一方面,5-HT參與細(xì)胞骨架重組的調(diào)節(jié),能引起平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元等細(xì)胞的細(xì)胞骨架重構(gòu),從而影響這些細(xì)胞的運動、分化。我們近期的工作初步觀察到:加入5-HT作用后,人巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞株Meg-01細(xì)胞增殖分化的同時出現(xiàn)肌動蛋白重構(gòu)。因此,我們設(shè)想:血清素可能通過5-HT2R介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu),促進前血小板形成和血小板釋放。
　　本研究希望通過探討血清

5、素對前血小板形成、巨核細(xì)胞骨架重構(gòu)及巨核細(xì)胞表面標(biāo)志的影響,完善對血小板產(chǎn)生規(guī)律以及血清素在血小板生成過程中的作用的認(rèn)識,有利于新型促血小板生成和釋放藥物的研發(fā),滿足臨床迅速提高血小板的迫切需要。
　　方法:本研究主要包括觀察血清素促使巨核細(xì)胞偽足形成、胞質(zhì)延伸形成前血小板、細(xì)胞骨架重構(gòu)和探索血清素對巨核細(xì)胞表面標(biāo)志 CD41的表達(dá)的影響兩部分。實驗分為4組,分別為:空白對照組;5-HT(200nmol/l)組;5-HT+Keta

6、nserin(5-HT200nmol/l,Ketanserin10μmol/l)組;TPO(50ng/ml)組。首先,分別運用倒置相差顯微鏡和MTT法再次驗證我們的前期工作,即血清素對巨核細(xì)胞增殖起促進作用;其次,采用倒置相差顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察血清素對巨核細(xì)胞胞質(zhì)形態(tài)改變、形成前血小板及細(xì)胞骨架重構(gòu)的影響;最后通過免疫細(xì)胞化學(xué)法探討血清素能否增強巨核細(xì)胞表面標(biāo)志CD41的表達(dá)。
　　結(jié)果:在倒置相差顯微鏡下觀察,5-HT組

7、和TPO組細(xì)胞密度均明顯高于對照組和5-HT+Ketanserin組,與 MTT法對細(xì)胞增殖定量研究的結(jié)果同時顯示:5-HT組和對照組、5-HT+Ketanserin組比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.01),和TPO組比較無顯著性差異(P>0.05)。倒置相差顯微鏡的觀察同時顯示,5-HT組和TPO組巨核細(xì)胞伸出偽足、胞質(zhì)延伸明顯多于對照組及5-HT+Kentaserin組,部分前血小板軸延伸長度甚至達(dá)胞質(zhì)本身長度的數(shù)倍,5-HT組巨核

8、細(xì)胞偽足形成但胞質(zhì)無延伸比率(22.7±5.98％)及偽足形成且胞質(zhì)延伸的比率(15.4±5.97%)與對照組(7.3±3.27%及3.6±1.56%)、5-HT+Ketanserin組(8.8±4.5%及5.3±3.31%)比較差異均有顯著性(P≤0.05),與TPO組(22.4±7.30%及7.5±3.59)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。透射電子顯微鏡的觀察可見5-HT組由胞漿延伸形成的軸突較多,其中含較多縱向分布的微管;軸

9、突周邊可見張力絲,軸突可見分叉,分叉處致密帶形成;胞體及軸突可見散在類似分隔膜系統(tǒng)的空泡狀內(nèi)容物及α顆粒;偶可見釋放出的血小板狀顆粒,顆粒中含α顆粒或(和)類似分隔膜系統(tǒng)的空泡狀內(nèi)容物。對照組及5-HT加拮抗劑組的巨核細(xì)胞形成的軸突較少,分叉不多,類似分隔膜系統(tǒng)的空泡狀內(nèi)容物及α顆粒較少5-HT組或無。TPO組可以見到與5-HT組類似的變化。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測巨核細(xì)胞表面分化抗原CD41,5-HT組和TPO組CD41陽性細(xì)胞率(分別為18