硫丹引起HUVEC-C細(xì)胞骨架重構(gòu)的機(jī)制分析.pdf

1、硫丹屬于持久性有機(jī)污染物，具有難降解性、生物蓄積性、長距離遷移性以及高毒性。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)硫丹具有內(nèi)皮細(xì)胞毒性，但硫丹對內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響尚不清楚。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-C)為實(shí)驗(yàn)對象，主要探討了硫丹對血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的影響及其信號通路，并著重分析了由于細(xì)胞骨架重構(gòu)而引起的血管內(nèi)皮通透性改變的分子機(jī)制。
　　本研究利用免疫染色法分析了硫丹暴露對HUVEC-C細(xì)胞骨架的微絲結(jié)構(gòu)(F-actin)和粘著斑激酶(

2、FAK)分布的影響，用qRT-PCR方法測定了骨架相關(guān)基因ROCK2和PXN的mRNA表達(dá)水平。用蛋白印記法(Western blot)分析了基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-3）、層粘連蛋白(LAMC1)、FAK和pFAK的表達(dá)。用RNAi干擾的方法探討了LAMC1對HUVEC-C細(xì)胞存活率、細(xì)胞骨架和內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。用Western blot和qRT-PCR方法分別檢測了細(xì)胞間粘附連接蛋白E-cadherin和β-catenin及縫隙連

3、接關(guān)鍵因子Cx43的變化。最后利用Coastertranswell system探討了硫丹暴露影響HUVEC-C細(xì)胞通透性的時(shí)間和劑量效應(yīng)。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫丹暴露能夠引起HUVEC-C細(xì)胞骨架破壞，ROCK2和PXN的mRNA表達(dá)降低，MMP-3蛋白表達(dá)升高而降解LAMC1，引起FAK和pFAK的表達(dá)降低，這些提示硫丹暴露可能通過影響MMP3/LAMC1/pFAK信號通路而破壞內(nèi)皮細(xì)胞骨架。LAMC1 siRNAs顯著降低HUV

4、EC-C細(xì)胞生存率，引起細(xì)胞骨架破壞和內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高，說明LAMC1在維持血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能中起重要作用。硫丹通過降低E-cadherin和β-catenin表達(dá)而影響內(nèi)皮細(xì)胞間連接。硫丹使縫隙連接功能減弱，與Cx43的表達(dá)降低有關(guān)。硫丹暴露48h導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性的升高，具有劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　本研究揭示了硫丹能夠通過破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的微絲結(jié)構(gòu)，減弱細(xì)胞間粘附連接和縫隙連接功能，從而引起了內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，影響血