PAK4對胃癌細(xì)胞骨架重組及細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究.pdf

1、前言：PAK(p21 activated kinase)為一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過其下游眾多的激酶底物和結(jié)合蛋白參與眾多的生物學(xué)功能。目前被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。迄今鑒定的PAK家族成員包括六個成員：PAK1-PAK6，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性分為兩類，Ⅰ類包括PAK1-3，Ⅱ類包括PAK4-6。兩類PAK在結(jié)構(gòu)上包括N末端保守的PBD結(jié)構(gòu)域(p21 binding domain)和C末端保守的激酶域(kinase

2、domain，KD)。
　　 PAK4是Ⅱ類PAK中最早被鑒定的，也是Ⅱ類PAK中最具有代表性的成員μ。與其他PAK家族成員一樣，PAK4與Ⅰ類PAK不同的是N末端不含有自我抑制域(auto inhibitory domain，AID)因此兩類PAK在活化方式和生物學(xué)功能上有所區(qū)別。PAK4在大多數(shù)組織中均有表達(dá)，在前列腺、睪丸及結(jié)腸中表達(dá)最高。重要的是PAK4在眾多腫瘤細(xì)胞系中有過表達(dá)，并且其定位于19號染色體的基因在人結(jié)腸、

3、卵巢及胰腺腫瘤中有擴(kuò)增現(xiàn)象。在對人大腸癌340種絲氨酸/蘇氨酸激酶突變篩查中發(fā)現(xiàn)了2個PAK4的基因突變。研究發(fā)現(xiàn)，激活型的PAK4可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的錨定非依賴性生長，而失活型的PAK4突變體(PAK4NE)則顯著抑制了Ras引起的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。雖然PAK4是Ⅱ類PAK中研究的最為廣泛的成員，但是目前發(fā)現(xiàn)的PAK4相互作用蛋白仍然十分有限，對PAK4的研究仍處于起步階段。通過與Rho家族GEF-H1(guanine nucleotide e

4、xchange factor H1)相互作用，PAK4可引起細(xì)胞形態(tài)改變。PAK4通過與G蛋白偶聯(lián)的Rho-GEF直接的相互作用，下調(diào)Rho活性，顯著減少了Rho的GTP結(jié)合形式，進(jìn)一步減少了血清或LPA刺激的應(yīng)力纖維的形成。PAK4通過與整合素αvβ5的相互作用，選擇性的促進(jìn)整合素αvβ5介導(dǎo)的細(xì)胞遷移。有報道證實(shí)LIMK1可以作為PAK1的磷酸化底物，最近研究證實(shí)，PAK4也可以磷酸化LIMK1。而活化的LIMK1可以磷酸化cofi

5、lin，有研究發(fā)現(xiàn)PAK4引起的細(xì)胞形狀改變依賴cofilin的磷酸化，這表明對LIMK1活性的調(diào)節(jié)對于細(xì)胞移動是必須的，同時也說明PAK4，LIMK1和cofilin之間存在著功能上的關(guān)聯(lián)。但對于PAK4引起的細(xì)胞遷移，仍然有很對機(jī)制等待研究。因此我們利用酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦文庫中篩選出若干PAK4相互作用蛋白，我們選擇了2個與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞骨架相關(guān)的進(jìn)行了研究，希望對PAK4促進(jìn)腫瘤細(xì)胞骨架重組及腫瘤細(xì)胞遷移的作用及機(jī)制進(jìn)行探

6、討。它們分別為DGCR6L和PKN1。
　　 DGCR6L是我們利用酵母雙雜交篩選出來的新的PAK4相互作用蛋白。GCR6L(DiGeorge critical region6 like)基因定位于染色體22q11，存在兩個高度同源的拷貝(DGCR6和DGCR6L)，最初發(fā)現(xiàn)在velo-cardio-facial syndrome/DiGeorgesyndrome(VCFS/DGS)中缺失。兩個基因高度同源，翻譯的蛋白質(zhì)均含有2

7、2個氨基酸殘基，且保守度達(dá)97％。DGCR6L在乳腺癌中高表達(dá)，并于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，但具體機(jī)制不詳。本研究中，我們將對PAK4與DGCR6L的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，并探索DGCR6L在PAK4引起的胃癌細(xì)胞遷移中的作用和機(jī)制。
　　 PKN1為RhoA和Rac1的下游靶蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組及細(xì)胞遷移。蛋白激酶C相關(guān)激酶1(PKC-related kinase1，PRK1)也稱為PKN或PKN1。是脂質(zhì)和RhoGTPase激活的絲氨酸

8、/蘇氨酸激酶，為PKC超家族一員，分子量為116KD。目前發(fā)現(xiàn)，該家族有三個成員，分別為PKN1、PKN2及PKN3，三者結(jié)構(gòu)相似，其中PKN1與PKN2的同源性為58％。PKN1的N末端(aal～560)包含三個重復(fù)亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)域，與蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)。C末端(aa561～942)有一個與蛋白激酶C(PKC)高度同源的催化結(jié)構(gòu)域，與激酶活化有關(guān)。
　　 PKN1的N末端含有兩個同源重復(fù)序列，HR1和HR2域。HR1域內(nèi)含有

9、三個重復(fù)亮氨酸拉鏈樣結(jié)構(gòu)，呈反向平行卷曲排列(anti-parallel coiled-coil)，也稱ACC重復(fù)序列，分別為HR1a(ACC1)，HR1b(ACC2)及HR1C(ACC3)。研究表明，RhoA能與PKN1的HR1a和HR1b結(jié)合，而不與HR1C結(jié)合。結(jié)合了GTP的RhoA即活化的RhoA只與HR1a(ACC1)結(jié)合，而結(jié)合了GTP的Rac1只與PKN1的HR1b區(qū)域(ACC2)結(jié)合。
　　 一些實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，P

10、RK1/PRK2作為RhoA和Rac1的下游靶蛋白或效應(yīng)器，通過與RhoA和Rac1的相互作用在細(xì)胞骨架重組及細(xì)胞遷移中發(fā)揮作用。例如，RhoA和Rac1與PKN2結(jié)合并激活PKN2.在NIH3T3成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入無激酶活性的PKN2突變體，會引起肌動蛋白應(yīng)力纖維降解，說明PKN2激酶活性可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重組。PI3K下游靶蛋白PDK1能直接激活PKN1，介導(dǎo)胰島素所致的肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，應(yīng)力纖維解聚，片狀偽足形成。
　　

11、實(shí)驗(yàn)材料及方法
　　 酵母配合實(shí)驗(yàn)(yeast mating assay)檢測DGCR6L與PAK4的相互作用。DGCR6L全長cDNA克隆到pGADT7載體后轉(zhuǎn)染至Y187酵母細(xì)胞，與轉(zhuǎn)染pGBKT7-PAK4N/C的AH109酵母細(xì)胞進(jìn)行配合實(shí)驗(yàn)，配合子接種于SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/x-α-gal培養(yǎng)板培養(yǎng)，生長并變藍(lán)為陽性克隆。
　　 蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)(GST pull-down assay

12、)證實(shí)PAK4與DGCR6L或PKN1的相互作用，并尋找相互作用區(qū)域。pCDNA3.1C-PAKs進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯同時摻入35S-methonine，得到35S-PAKs；與體外純化的GST-DGCR6/L或GST-PKN1 s融合蛋白進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)；通過構(gòu)建相應(yīng)蛋白的截短蛋白，利用GST-pulldown實(shí)驗(yàn)檢測蛋白相互作用的區(qū)域。
　　 免疫共沉淀(Immunoprecipitation)/免疫印跡(we

13、stern blot)驗(yàn)證蛋白在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的相互作用。免疫熒光檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位或者是相互作用蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位。我們利用融合的熒光蛋白或者免疫熒光檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。GFP或DsRed融合的蛋白通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，然后利用激光共焦掃描顯微鏡檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。細(xì)胞內(nèi)源性蛋白的定位通過免疫熒光的方式檢測。細(xì)胞內(nèi)的微絲和微管分別利用特異性的結(jié)合蛋白進(jìn)行標(biāo)記。利用激光共焦掃描顯微鏡檢測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　

14、DGCR6/L穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系建立用于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。將pCDNA3.1C-DGCR6/L轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞，利用G418進(jìn)行篩選，得到DGCR6/L穩(wěn)定表的的AGSDGCR6/L細(xì)胞。
　　 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證胃癌細(xì)胞的遷移能力改變。在PAK4和DGCR6L蛋白過表達(dá)或沉默表達(dá)條件下，檢測細(xì)胞遷移能力變化。3次以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 激酶反應(yīng)檢測PAK4對DGCR6L或PKN1的磷酸化。利用體

15、外激酶反應(yīng)，檢測PAK4對DGCR6L、β-actin及PKN1的磷酸化；利用體外激酶反應(yīng)檢測PKN1對PAK4的磷酸化。
　　 結(jié)果
　　 1.利用酵母配合實(shí)驗(yàn)，DGCR6L與PAK4C發(fā)生相互作用；體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PAK4特異性的與DGCR6L結(jié)合。
　　 2.PAK4通過其466-572aa區(qū)域與DGCR6L結(jié)合，并且DGCR6L的基酸殘基6G，14G，115L在結(jié)合中起重要作用。
　　 3.PA

16、K4與DGCR6L在胃癌細(xì)胞SGC-7901中相互作用并有共定位，但不直接結(jié)合。
　　 4.PAK4在胃癌細(xì)胞SGC7901中與β-actin形成復(fù)合體，但經(jīng)檢測沒有直接結(jié)合且PAK4不磷酸化β-actin；DGCR6L對于PAK4與β-actin形成復(fù)合體是必須的。
　　 5.PAK4、DGCR6L和肌動蛋白微絲在SGC-7901細(xì)胞中兩兩共定位；DGCR6L可以劑量依賴性的促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)LIMK1及cofilin的磷酸化

17、水平。
　　 6.穩(wěn)定表達(dá)的DGCR6L促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移；沉默DGCR6L表達(dá)后細(xì)胞遷移能力下降，在此基礎(chǔ)上沉默PAK4表達(dá)細(xì)胞的遷移能力進(jìn)一步下降。
　　 7.PAK4通過其激酶域與PKN1的HR2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。
　　 8.PKN1磷酸化PAK4，磷酸化位點(diǎn)位于PAK4的1-118aa。
　　 9.PKN1和PAK4在胃癌細(xì)胞SGC-7901內(nèi)有共定位，且二者分別可以定位于高爾基復(fù)合體。
　　

18、10.PKN1的表達(dá)使PAK4定位于細(xì)胞的肌動蛋白微絲，且三者有共定位。
　　 11.PKN1和PAK4與細(xì)胞的微管有共定位。
　　 結(jié)論：
　　 1.DGCR6L和PKN1分別是PAK4新的相互作用蛋白。
　　 2.DGCR6L通過促進(jìn)LIMK1磷酸化水平調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動蛋白骨架促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。
　　 3.PKN1磷酸化PAK4的N-末端，且位點(diǎn)位于1-201aa區(qū)域。
　　 4.PKN1