正己烷中毒性神經(jīng)病細(xì)胞骨架變性及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的: 正己烷（n-hexane）是一種常用的工業(yè)溶劑，主要應(yīng)用于粘膠配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制藥、家具制造及電子元件制造等行業(yè)。由于正己烷的急性毒性較低，而使人們忽視了長(zhǎng)期慢性低濃度接觸正己烷可導(dǎo)致以感覺運(yùn)動(dòng)型多發(fā)性周圍神經(jīng)病為主要臨床特征的慢性中毒。 正己烷中毒患者早期表現(xiàn)為手足發(fā)麻、刺痛、蟻?zhàn)吒?、手足部痛覺、觸覺減退呈手套、襪套樣分布等，進(jìn)一步發(fā)展可表現(xiàn)為四肢無力、行走困難以至不能站立甚

2、至出現(xiàn)下肢癱瘓及肌肉萎縮。神經(jīng)病理檢查發(fā)現(xiàn)損傷最初發(fā)生在遠(yuǎn)端最長(zhǎng)、最粗的感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸索，并且在郎飛氏節(jié)附近形成巨大的充滿神經(jīng)絲（neurofilament，NFs）的腫脹，郎飛氏節(jié)解剖結(jié)構(gòu)扭曲且髓鞘從腫脹處回縮，有時(shí)伴有節(jié)段性脫髓鞘，最后一些遠(yuǎn)離神經(jīng)腫脹部位的軸索發(fā)生變性。盡管許多工作致力于正己烷中毒性神經(jīng)病的研究，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚?；谡和橹卸镜某⒔Y(jié)構(gòu)觀察和組織病理學(xué)改變，為進(jìn)一步探討正己烷中毒性神經(jīng)病發(fā)生的分子機(jī)制，我們

3、建立了正己烷終毒物2，5-己二酮（2，5-hexanedione，HD）亞慢性中毒大鼠模型，以細(xì)胞骨架蛋白為切入點(diǎn)，觀察中毒性神經(jīng)病發(fā)生過程中NFs、微管（α-tubulin、β-tubulin）和微絲（β-actin）蛋白相對(duì)含量的變化，確定作用靶點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上從細(xì)胞骨架蛋白降解的角度進(jìn)一步探討細(xì)胞骨架蛋白變化的原因，包括磷酸化及其相應(yīng)蛋白激酶信號(hào)通路的變化、泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，

4、UPS）的改變等等，為正己烷職業(yè)中毒的預(yù)防和治療提供可以借鑒的基礎(chǔ)資料。同時(shí)，探討血清中各骨架蛋白含量的變化評(píng)價(jià)正己烷接觸的效應(yīng)標(biāo)志物以檢測(cè)和評(píng)價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的可行性，為正己烷等毒物神經(jīng)毒性的臨床監(jiān)測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法: 1．雄性Wistar大鼠用200和400 mg/kg．bw的HD腹腔注射染毒，染毒時(shí)間8周（每周染毒5d，每日1次），建立正己烷中毒性周圍神經(jīng)病模型。 2．取大鼠大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織在

5、勻漿緩沖液（1％Triton X-100，50 mM Tris（pH7．5），25 mM KC1，2 mM MgCl2，5 mM EGTA，5 mM dithiothreitol，ProteaseInhibitor Cocktail（50ul/g tissue）and phosphatase inhibitors（5 mM Na3VO4，10mM Na4P2O7 and1 mM iodoacctic acid）中制備勻漿，100，000

6、×g、4℃離心60 min。采用Western-Blotting技術(shù)研究大鼠大腦、脊髓、坐骨神經(jīng)上清和沉淀以及血清中phos-NF-H（pNF-H）、phos-&n-phos-NF-H（p&n-pNF-H）、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin等骨架蛋白。 3．神經(jīng)組織通過勻漿緩沖液A（20 mM Tris-HCL buffer（PH7．4），1 mM DTT，5mM EGTA，2 mM E

7、DTA，10％glycerol，1 mM MgCl2，1 mM PMSF，2μg/mlaprotinin，and2μg/ml leupeptin）和B（100 mM KC1，5 mM NaCl，3 mM MgCl2，50 mM Hepes，pH7．4，1 mM dithiothreitol（DTT），0．5μg/ml aprotinin，0．5μg/mlleupeptin，200μM PMSF and1 mM EGTA）制備組織勻漿，然

8、后27，000×g、4℃離心60 min提取神經(jīng)組織胞膜和胞漿蛋白組分，分別測(cè)定鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/CaM-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、周期蛋白依賴性的蛋白激酶5（cyclin dependent kinase5，CDK5）和CDK

9、5相關(guān)因子含量的變化。 4．取大鼠大腦、脊髓和坐骨神經(jīng)組織胞膜和/或胞漿蛋白組分，利用放射性同位素技術(shù)研究HD染毒對(duì)大鼠神經(jīng)組織中CaMKⅡ、PKA、PKC和CDK5活性的影響。 5．真核表達(dá)Flag-NFM質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、鑒定、擴(kuò)增和提純。 6．培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，將不同質(zhì)粒按不同目的需要組合，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，采用免疫共沉淀和Western-blotting等技術(shù)檢測(cè)HD染毒情況下NF

10、s與E3連接酶的結(jié)合、泛素化以及被蛋白酶體降解情況。 7．神經(jīng)組織在相應(yīng)勻漿液（50 mM Tris HC1，pH7．4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1％Triton X-100 and1％Protease Inhibitor Cocktail）中8200×g、4℃離心30min，取上清，測(cè)定UPS系統(tǒng)中各組分E1、E3泛素連接酶和蛋白酶體的含量和活性。 結(jié)論: 1．NFs比微管和微絲更加敏感，易

11、受HD損傷，可能是正己烷中毒性神經(jīng)病的分子靶點(diǎn)。 2．pNF-H含量在HD中毒大鼠血清中明顯升高，并與大鼠神經(jīng)行為異常呈明顯的相關(guān)性，表明pNF-H可作為HD中毒性神經(jīng)病早期診斷的生物標(biāo)志物。 3．HD中毒導(dǎo)致大鼠神經(jīng)組織CaM、PKA、PKC和CDK5的含量和活性以及NFs聚合率的變化，表明NFs相關(guān)蛋白信號(hào)通路和NFs磷酸化狀態(tài)改變可能參與了HD中毒性神經(jīng)病的發(fā)生。 4．由于CaMKII在脊髓和坐骨神經(jīng)組織中

12、為檢測(cè)到，說明Ca2+-CaM-CaMKII-NFs磷酸化信號(hào)通路可能部分地參與了HD中毒性神經(jīng)病發(fā)生。 5．PKA、PKC和CDK5活性在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)能夠變化不一致，可能決定了NFs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)通過不同的途徑降解。 6．CHIP作為一種含U-box結(jié)構(gòu)域的E3連接酶促進(jìn)NFs泛素化并通過蛋白酶體降解。 7．蛋白酶體抑制劑MG132部分地抑制了HD促進(jìn)NFs降解，說明UPS通路在HD