Sp1和長(zhǎng)鏈非編碼RNA CDKN2B-AS1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用對(duì)胃癌細(xì)胞增殖作用的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過(guò)序列特異性的DNA結(jié)合蛋白與靶基因啟動(dòng)子區(qū)GC/GT盒結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)，在細(xì)胞增生、凋亡、分化和腫瘤形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是影響腫瘤患者預(yù)后的重要因素。Sp1啟動(dòng)子區(qū)有包括Sp1在內(nèi)等多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，可影響Sp1轉(zhuǎn)錄活性，但胃癌發(fā)生過(guò)程中是否發(fā)生Sp1啟動(dòng)子區(qū)遺傳學(xué)異常并引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化還不清楚。同時(shí)，研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)作為編碼蛋白的“失能”產(chǎn)物，從遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄

2、后水平調(diào)控基因的表達(dá)，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。基因組中某些轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)既可轉(zhuǎn)錄編碼蛋白的mRNA也轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用的lncRNA，而lncRNA往往能夠反饋調(diào)控同源蛋白編碼基因的表達(dá)。鑒于Sp1在胃癌發(fā)生過(guò)程中的重要作用，篩選與Sp1表達(dá)相關(guān)的lncRNA，圍繞Sp1與lncRNA之間的調(diào)控作用，探討兩者間相互作用對(duì)于胃癌細(xì)胞生物學(xué)的影響十分必要。
　　研究目的：
　　本研究以Sp1啟動(dòng)子為研究對(duì)象，在其啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)

3、突變發(fā)生情況，以建立突變與Sp1蛋白表達(dá)的相關(guān)性;通過(guò)查找數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合Sp1“過(guò)表達(dá)”和“干擾”策略，力圖在胃癌細(xì)胞中篩選出與Sp1表達(dá)密切相關(guān)的lncRNA，并探討lncRNA與Sp1之間的反饋調(diào)節(jié)作用對(duì)于胃癌細(xì)胞SGC7901增殖作用的影響。
　　研究方法：
　　首先在101例胃癌患者的病理組織進(jìn)行抽提DNA并進(jìn)行克隆測(cè)序，在12例胃癌病理樣本中檢測(cè)到Sp1基因啟動(dòng)子區(qū)-684位C→T，-637位T→C和-617位T→G

4、三種類型突變，之后對(duì)病理樣本進(jìn)行免疫組化并標(biāo)化評(píng)分，對(duì)Sp1蛋白表達(dá)與突變之間相關(guān)性進(jìn)行分析。之后以PGL-3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒系統(tǒng)為工具，構(gòu)建分別含有上述3個(gè)位點(diǎn)突變啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性來(lái)反映含有突變位點(diǎn)的啟動(dòng)子活性;接下來(lái)通過(guò)生物信息學(xué)分析上述突變位點(diǎn)是否與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列相關(guān)，并對(duì)突變位點(diǎn)與患者臨床病理特征及預(yù)后進(jìn)行了綜合分析以探討兩者間聯(lián)系。
　　為探討Sp1表達(dá)異常的機(jī)制，我們通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩

5、選出與腫瘤相關(guān)的lncRNA分子，并構(gòu)建Sp1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾片段，在胃癌細(xì)胞中篩選與Sp1表達(dá)相關(guān)的lncRNA;接下來(lái)我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)lncRNA基因的小干擾RNA，在確認(rèn)干擾效率的基礎(chǔ)上，探討lncRNA對(duì)于Sp1表達(dá)的影響;通過(guò)共轉(zhuǎn)染lncRNA的RNAi和熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，我們初步探討了lncRNA與Sp1啟動(dòng)子活性的相關(guān)性。最后我們通過(guò)CCK8、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕和Transwell等實(shí)驗(yàn)分別探討了Sp1和lncRNA對(duì)胃癌

6、細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響
　　研究結(jié)果：
　　我們?cè)?2例胃癌病理樣本中檢測(cè)到Sp1基因啟動(dòng)子區(qū)-684位C→T，-637位T→C和-617位T→G三種類型突變，發(fā)生頻率分別為3.96％(4例)，5.94％（6例）和1.98％(2例)，通過(guò)IHC檢測(cè)Sp1表達(dá)，采用Fisher精確概率法分析發(fā)現(xiàn)Sp1蛋白表達(dá)與突變之間相關(guān)性p＞0.05;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)揭示含有-684位C→T和-617位T→G突變啟動(dòng)子活性增強(qiáng)

7、(p＜0.05)，而-637位T→C突變啟動(dòng)子活性與對(duì)照組相比未發(fā)生明顯變化(p=0.319＞0.05)，生物信息學(xué)分析提示上述三個(gè)突變位點(diǎn)并未位于既有/潛在的Sp1啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);而統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明突變位點(diǎn)與患者臨床病理特征及預(yù)后之間沒(méi)有相關(guān)性。
　　通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并結(jié)合Sp1“過(guò)表達(dá)”和“干擾”策略，我們發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1，H19，KCNQ1OT1，MIR31HG和XIST等5個(gè)lncRNA與Sp1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

8、;而干擾CDKN2B-AS1表達(dá)后Sp1的mRNA和蛋白水平均上升;熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明這一干擾效應(yīng)能夠上調(diào)Sp1啟動(dòng)子的活性，且該效應(yīng)與突變發(fā)生與否無(wú)關(guān)。
　　胃癌細(xì)胞生物學(xué)研究中，Sp1過(guò)表達(dá)和干擾CDKN2B-AS1表達(dá)能促進(jìn)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖，干擾Sp1表達(dá)使凋亡的胃癌細(xì)胞數(shù)量增加;而干擾CDKN2B-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲無(wú)明顯影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.Sp1基因啟動(dòng)子區(qū)檢測(cè)到的-6