長鏈非編碼RNA GHET1對人胃癌細胞MGC803生物學性狀的影響.pdf

1、目的：
　　檢測長鏈非編碼RNA GHET1（long non-coding RNA gastric carcinoma high expressed transcript1，lncRNA GHET1）在胃癌組織和細胞中的表達情況，探索其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討其可否作為檢測和治療胃癌的潛在分子靶標。
　　方法:
　　（1）收集35例胃癌組織及癌旁組織，采用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(quantitativ

2、e real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測胃癌組織和癌旁組織中GHET1的表達，結合臨床資料分析GHET1與胃癌臨床病理特征的關系。
　?。?）檢測人胃癌細胞株AGS, SGC-7901, BGC-823,MGC803,HGC-27細胞和正常胃粘膜細胞株GES-1中GHET1的表達，篩選體外沉默GHET1基因合適的胃癌細胞模型。
　?。?）設計針對 GHET1的特異性序

3、列siRNA（small interference double-stranded RNA,siRNA）4條，非特異性siRNA陰性序列1條、陽性干擾甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)序列、陰性標記羧基熒光素（FAM）序列各1條；實驗分為空白組(control)、陰性對照組（si-NC）、陽性對照組（si-GAPDH）、陰性熒光標記組（si-FAM）和GHET1沉默組（si-GHET1）5組。運用倒臵熒光顯微鏡觀察轉染效率。采用實時熒

4、光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測驗證siRNA干擾后GHET1的表達情況，比較4條siRNA的抑制率，篩選出一條最佳的干擾序列。
　　（4）應用干擾效率最佳的GHET1-siRNA轉染篩選出來的胃癌細胞株。運用CCK8法檢測降低GHET1表達對胃癌細胞增殖及5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）敏感性的影響；流式細胞術(FCM)檢測轉染后細胞周期與凋亡變化；Hoechst33342染色觀察細胞凋亡的形態(tài)影響

5、；細胞劃痕實驗以及Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。最后Western blot檢測細胞凋亡及周期相關蛋白caspase3、PARP、Bcl-2、PCNA、CDK2、CDK4、pRB表達的改變。
　　結果：
　　（1）qRT-PCR檢測 GHET1在胃癌組織中表達增高（P<0.01），且與胃癌的侵襲和TNM分期相關(P<0.01)；
　?。?）在分化程度不同的人胃癌細胞株中，GHET1基因表達不同程度的上

6、調，其中以MGC803表達上調(4.39〒0.75)最為顯著(P<0.01)。
　　（3）當轉染熒光效率高于80％，qRT-PCR結果顯示si-GHET1-01的干擾效果最好干擾效率為（51.86〒6.99）%(P<0.001)。
　?。?）CCK-8結果顯示，MGC803細胞中 GHET1的表達下調可抑制細胞增殖(P<0.05)，但不能增加細胞對5-Fu的敏感性(P>0.05)。
　?。?）細胞周期結果顯示,沉默 G

7、HET1細胞 G0/G1期比例升高，S期的比例降低(P<0.01)。
　?。?）細胞凋亡結果顯示，si-GHET1組細胞凋亡率無顯著性改變，(P>0.05)。
　?。?）Hoechst33342染色結果顯示，沉默GHET1對細胞凋亡的形態(tài)影響無差異性，結果與流式結果一致。
　?。?）細胞劃痕實驗顯示，沉默GHET1細胞愈合能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。
　　（9）Transwell小室侵襲、遷

8、移實驗顯示，沉默GHET1侵襲和遷移地細胞穿過膜的數(shù)目顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)。
　?。?0）Western blot檢測細胞凋亡及增殖相關蛋白，與空白組及陰性對照組相比， si-GHET1組caspase3、PARP、Bcl-2的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。PCNA、CDK2、CDK4、pRB的蛋白表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：
　　（1）GHET1基因在