長鏈非編碼RNA URHC在肝癌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,肝癌)是成人肝臟惡性腫瘤中最常見的疾病,雖然肝癌的治療技術(shù)不斷提升,如手術(shù)切除、肝移植、放化療,但肝癌患者總體5年生存率至今仍未明顯改善。肝癌病死率高、預(yù)后差的重要原因之一就是肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制目前仍然知之甚少。然而,隨著現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)的進(jìn)展,現(xiàn)已證明肝癌的形成多伴隨一系列分子及信號通路的異常。因此,從分子水平探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,并將特征

2、性分子作為抗腫瘤靶點(diǎn),可為臨床預(yù)防和治療肝癌開辟新的途徑。
　　長鏈非編碼RNA(long non-coding,lncRNA)是近年來研究的熱點(diǎn),它是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,無或很少具有蛋白質(zhì)編碼功能,曾被認(rèn)為基因轉(zhuǎn)錄的“暗物質(zhì)”,但目前發(fā)現(xiàn)lncRNA具有重要的生物學(xué)功能,如調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等。除此之外,lncRNA的異常表達(dá)與人類疾病密切相關(guān),尤其在腫瘤方面。現(xiàn)已在乳腺癌、胃癌、肺

3、癌、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNA異常表達(dá),且這些lncRNA主要參與腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等過程,提示lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到癌基因或抑癌基因的作用。
　　與既往研究較多的microRNA(miRNA)相比,lncRNA仍然屬于一個相對未知領(lǐng)域。目前,lncRNA在肝癌中的研究仍較少,即使發(fā)現(xiàn)了幾種與肝癌相關(guān)的lncRNA,但仍只是冰山一角,且部分lncRNA具體功能不清,絕大數(shù)lncRNA分

4、子調(diào)控機(jī)制不明確,因此仍有必要繼續(xù)尋找與肝癌相關(guān)異常表達(dá)的lncRNA,并探索其功能,進(jìn)一步挖掘其分子生物學(xué)機(jī)制,從而更加完善肝癌的分子基礎(chǔ)研究。
　　本課題應(yīng)用lncRNA芯片檢測正常肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的差異,初步篩選出與肝癌相關(guān)的lncRNA,并進(jìn)一步探討lncRNA在肝癌中的作用及機(jī)制,為將來深入研究lncRNA打下基礎(chǔ)。
　　【目的】
　　利用基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的lncRNA并確定一個

5、新的lncRNA,命名為URHC(up-regulated in hepatocellular carcinoma),探討URHC在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其分子調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而從新的角度闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為日后臨床分子治療肝癌提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1、利用lncRNA表達(dá)譜芯片檢測并比較HepG2、SMMC7721、Huh7等3種肝癌細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞系HL-7702的lncRNA表達(dá)情況,從表達(dá)水平、ln

6、cRNA長度、數(shù)據(jù)庫完整lncRNA序列、GO富集及KEGG pathway分析等方面篩選與肝癌相關(guān)的差異表達(dá)的lncRNA,利用實(shí)時(shí)定量 PCR(qRT-PCR)在肝癌細(xì)胞系和組織中驗(yàn)證部分差異表達(dá)的lncRNA,最后確定URHC為后續(xù)研究對象。
　　2、收集52例行肝癌切除術(shù)患者的肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織,采用qRT-PCR方法檢測URHC表達(dá),并分析URHC表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　3、URHC的體外功

7、能研究:選用高水平表達(dá)URHC的肝癌細(xì)胞系SMMC7721作為研究對象,轉(zhuǎn)染URHC特異性siRNA抑制URHC表達(dá)水平,體外分別利用MTT、EdU、細(xì)胞周期、平板克隆形成、細(xì)胞凋亡、Western-blot、Transwell等實(shí)驗(yàn)觀察其對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　4、URHC靶基因的預(yù)測、驗(yàn)證及功能研究:結(jié)合基因定位分析和生物信息預(yù)測,推測ZAK可能是URHC的潛在靶點(diǎn)之一;qRT-PCR檢測ZA

8、K在肝癌組織中的表達(dá)情況,并利用 qRT-PCR和Western-blot驗(yàn)證 URHC與 ZAK之間的表達(dá)關(guān)系;SMMC7721細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 URHC-siRNA、ZAK-siRNA、共轉(zhuǎn)染 ZAK-siRNA與URHC-siRNA,利用MTT、細(xì)胞周期及Western-blot等方法探索URHC是否通過ZAK發(fā)揮作用。
　　5、URHC調(diào)控的分子機(jī)制研究:利用 Western-blot檢測 MAPK通路重要蛋白的活化水平,并利

9、用蛋白磷酸酶抑制劑 PD98059和功能實(shí)驗(yàn)對 ERK/MAPK通路進(jìn)行驗(yàn)證。
　　【結(jié)果】
　　1、與正常肝細(xì)胞相比,我們選取在3種肝癌細(xì)胞系中同時(shí)高或低水平表達(dá)且2倍以上變化的lncRNA,認(rèn)為其差異表達(dá)有意義。采用聚類分析,發(fā)現(xiàn)總共有1658個lncRNA差異表達(dá),占所有l(wèi)ncRNA的3.9％,其中2倍以上共有477個lncRNA同時(shí)上調(diào),2倍以上共有1181個lncRNA同時(shí)下調(diào);5倍以上同時(shí)上調(diào)56個,5倍以上同時(shí)

10、下調(diào)131個。這些差異表達(dá)的lncRNA與細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等相關(guān)基因有關(guān),部分還可能參與MAPK、JAK-STAT、Wnt等信號通路調(diào)節(jié)。
　　2、通過基因芯片和組織篩選,我們發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA URHC,其在3種肝癌細(xì)胞系中均高表達(dá),經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證,lncRNA URHC在肝癌細(xì)胞和肝癌組織中同時(shí)上調(diào)表達(dá),符合基因芯片結(jié)果。URHC在57.7%(30/52)的肝癌組織中高表達(dá),URHC表達(dá)與腫瘤的體積(

11、χ2=8.868,P=0.003)與腫瘤數(shù)目(χ2=6.857,P=0.009)顯著相關(guān),而與年齡、性別、AFP水平、腫瘤轉(zhuǎn)移、門靜脈癌栓、組織分化及AJCC分期等特征無明顯相關(guān)(P>0.05),Kaplan-Meier分析示URHC高表達(dá)與患者低生存率有關(guān)(χ2=4.863,P=0.027)。
　　3、qRT-PCR結(jié)果示 siRNA干擾后URHC表達(dá)下調(diào);MTT、EdU結(jié)果表明較對照組,下調(diào)URHC表達(dá)顯著降低細(xì)胞增殖能力;細(xì)

12、胞周期結(jié)果表明URHC表達(dá)抑制后G0/G1期細(xì)胞顯著增多,而S期細(xì)胞顯著降低;平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,抑制URHC表達(dá)后細(xì)胞克隆形成數(shù)目較對照組顯著減少;流式細(xì)胞術(shù)顯示抑制URHC表達(dá)后細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組;Western-blot示 URHC表達(dá)下調(diào)顯著增加了促凋亡蛋白Bax的表達(dá),提高Bax/Bcl-2之間的比例;除此之外,URHC表達(dá)下調(diào)后,cleaved caspase3蛋白表達(dá)上調(diào),且cleaved caspase3/cas

13、pase3比例顯著升高,以上表明下調(diào)URHC表達(dá)能有效抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡;Transwell實(shí)驗(yàn)表明抑制URHC表達(dá)對細(xì)胞的侵襲及遷移能力沒有影響。
　　4、基因定位分析發(fā)現(xiàn)ZAK位于URHC基因附近,提示URHC可能以cis-acting作用方式調(diào)控其表達(dá);qRT-PCR發(fā)現(xiàn)ZAK在肝癌組織中顯著低表達(dá),且肝癌組織中URHC與ZAK表達(dá)呈負(fù)相關(guān),URHC表達(dá)抑制后ZAK在mRNA水平和蛋白水平均表達(dá)上調(diào),提示ZAK可能是

14、URHC作用的潛在靶基因,且URHC通過負(fù)調(diào)控ZAK表達(dá)發(fā)揮作用。MTT示干涉 URHC表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖的能力可以部分被下調(diào)ZAK表達(dá)所削弱;細(xì)胞周期結(jié)果表明ZAK下調(diào)減少了URHC下調(diào)所致G0/G1期細(xì)胞量的增加水平。Western-blot示ZAK表達(dá)下調(diào)降低了Bax蛋白及cleaved caspase3蛋白水平,表明ZAK下調(diào)與凋亡抑制有關(guān),且抑制ZAK表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)URHC抑制所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力。以上表明,URHC通過抑制

15、ZAK表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。
　　5、Western-blot示URHC表達(dá)下調(diào)后ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平顯著上調(diào),而ZAK與URHC表達(dá)同時(shí)抑制減弱了ERK1/2、JNK及p38的磷酸化水平,但高于單純ZAK表達(dá)抑制,說明下調(diào)URHC表達(dá)可促進(jìn)ZAK表達(dá)并激活MAPK通路。后續(xù)的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明PD98059能部分逆轉(zhuǎn)URHC下調(diào)所致的抑制細(xì)胞增殖作用,且削弱了URHC下調(diào)介導(dǎo)的促細(xì)胞凋亡能力。以上結(jié)果

16、說明URHC發(fā)揮促增殖、抑凋亡是通過抑制ZAK表達(dá),并失活下游ERK/MAPK通路來實(shí)現(xiàn)的。
　　【結(jié)論】
　　1、我們發(fā)現(xiàn)并鑒定了一個新的lncRNA URHC,其在肝癌細(xì)胞及肝癌組織中均高表達(dá),URHC的表達(dá)與肝癌患者的病理特征相關(guān),且可預(yù)測肝癌患者預(yù)后。
　　2、下調(diào)URHC表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡,但對肝癌細(xì)胞侵襲及遷移無明顯影響,提示URHC可能主要通過促進(jìn)腫瘤的惡性生長發(fā)揮作用。
　　3、URH