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文檔簡(jiǎn)介
1、片姜黃是許多名老中醫(yī)防治慢性肝炎、肝硬化和肝癌經(jīng)驗(yàn)方中的主要藥物之一,大量的實(shí)驗(yàn)研究表明姜黃、菖蒲、莪術(shù)和郁金等中藥的提取物——姜黃素,具有抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。課題研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過(guò)上調(diào)lncRNA AK125910而抑制肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,從而調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展。
目的:
借助lncRNA表達(dá)譜芯片,篩選姜黃素對(duì)lncRNA的調(diào)控作用,進(jìn)一步深入研究lncRNA AK125910在肝癌
2、發(fā)生的調(diào)控作用以及姜黃素的干預(yù)機(jī)制。揭示lncRNAAK125910與肝癌的內(nèi)在聯(lián)系,以及姜黃素抑制肝癌細(xì)胞的作用與lncRNA AK125910的關(guān)系。
方法:
1.采用lncRNA芯片篩選姜黃素處理肝癌細(xì)胞的相關(guān)lncRNA,并使用熒光定量PCR和western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證;構(gòu)建siRNA-AK125910瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞,下調(diào)lncRNAAK125910的表達(dá)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Brdu標(biāo)記檢
3、測(cè)細(xì)胞增殖,Transewell檢測(cè)細(xì)胞侵襲;
2.使用生物信息學(xué)技術(shù)檢測(cè)lncRNAAK125910的下游靶基因,并使用熒光定量PCR和western blot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證;
3.在構(gòu)建siRNA-AK125910瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上,檢測(cè)與肝癌細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)情況,對(duì)姜黃素調(diào)控lncRNAAK125910的分子機(jī)制初步探索。
結(jié)果:
1.使用lncRNA表達(dá)芯片,證實(shí)在姜黃素處
4、理的肝癌細(xì)胞中,lncRNA的fold change>5的lncRNA有7條,其中有5條表達(dá)增高,包括AK125910、uc009ycs、HMlincRNA717、chrⅩ:149438637-149438034和chr7:155933475-155996100;而2條表達(dá)降低,包括chr1:17129210938-17129213215和AP1879664;其中AK125910的表達(dá)上調(diào)最明顯,為9.78倍。RealtimePCR的結(jié)
5、果顯示,lncRNAAK125910的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào),為空白對(duì)照組的8.92±2.33倍(p<0.001),這與芯片結(jié)果一致,表明lncRNAAK125910在姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中起到了調(diào)控作用。
2.使用MTT、brdu標(biāo)記和Transwell法檢測(cè)了lncRNAAK125910在姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中的作用研究,證實(shí)了lncRNA AK125910參與了姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,抑制其增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
3
6、.通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNAAK125910的下游靶基因?yàn)镸UC2和SPAG4,并由RelatimePCR和western blot驗(yàn)證lncRNAAK125910增強(qiáng)MUC2的表達(dá)而抑制SPAG4的表達(dá)。
4.通過(guò)Relatime PCR和western blot對(duì)lncRNAAK125910在姜黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用,lncRNA AK125910參與調(diào)控Bcl-2和BAX、caspase-3和-
7、8、MMP-2和-9的表達(dá)。
結(jié)論:
1.肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNAAK125910表達(dá)明顯升高,姜黃素能下調(diào)肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNAAK125910;
2.下調(diào)lncRNAAK125910的表達(dá),能抑制肝癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲,姜黃素通過(guò)上調(diào)lncRNAAK125910而促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖和侵襲;
3.lncRNAAK125910增強(qiáng)MUC2的表達(dá)而抑制SPAG4的表達(dá),同時(shí)參與調(diào)
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