長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR通過(guò)上調(diào)GLUT1表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞糖酵解實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肝癌在我國(guó)屬于高發(fā)的且危害極大的實(shí)體惡性腫瘤之一，其發(fā)病過(guò)程及其復(fù)雜。然而，目前對(duì)于肝癌的治療卻不能達(dá)到令人滿意的效果，無(wú)論采用何種治療方式，其預(yù)后往往較差，對(duì)于提高總體生存率的作用很有限。目前，人們將焦點(diǎn)集中于肝癌其發(fā)病機(jī)制的研究。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-codingRNA，lncRNA)在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中起到了重要的作用。在肝癌中，HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcr

2、ipt antisense RNA，lncRNA-HOTAIR)是一個(gè)促癌基因。目前的研究表明，LncRNA-HOTAIR與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后息息相關(guān)。此外，在肝癌等實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，常常伴隨有細(xì)胞能量代謝方式的改變，不同于正常細(xì)胞依賴于氧化磷酸化為其提供必要的能量需求，肝癌細(xì)胞并不依靠這種供能效率更高的方式產(chǎn)生能量而是主要依賴于糖酵解。即使在氧氣充足的情況下，肝癌等實(shí)體腫瘤依然不通過(guò)氧化磷酸化為其功能，而是通過(guò)

3、有氧糖酵解為其提供必要的能量來(lái)源，這種有氧糖酵解的現(xiàn)象稱之為沃伯格效應(yīng)（Warburg effect）。Warburg效應(yīng)的意義不僅在于其能為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的能量，還在于通過(guò)這種方式，可以為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)基礎(chǔ)，最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥性等多個(gè)方面。那么lncRNA-HOTAIR既然能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，是否也可以通過(guò)促進(jìn)其能量代謝方式的改變，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展呢？如果能夠產(chǎn)生影

4、響，那又是通過(guò)什么機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的呢？本課題擬通過(guò)western blot，PCR，RIP等實(shí)驗(yàn)技術(shù)探索lncRNA-HOTAIR是否能夠調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞能量代謝，以及其具體機(jī)制，從而為肝癌的臨床診治提供新的方向、思路與理論基礎(chǔ)。
　　方法：⑴選取84例肝癌患者肝癌組織及癌旁組織，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)肝癌組織lncRNA-HOTAIR的表達(dá)及其表達(dá)與臨床病病理參數(shù)的關(guān)系；⑵應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)肝癌細(xì)胞系HepG

5、2，SMMC-7721，Hep3B，Huh7，Bel-7402中l(wèi)ncRNA-HOTAIR的表達(dá)情況；⑶應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建高/低表達(dá)lncRNA-HOTAIR的肝癌細(xì)胞系，并應(yīng)用CCK8試劑盒檢測(cè)高/低lncRNA-HOTAIR肝癌細(xì)胞系增殖能力的變化；⑷應(yīng)用葡萄糖檢測(cè)試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)高/低lncRNA-HOTAIR肝癌細(xì)胞系中糖酵解的情況；⑸應(yīng)用real time-PCR，western blot檢測(cè)高表達(dá)lncRNA

6、-HOTAIR肝癌細(xì)胞系中糖酵解關(guān)鍵酶及關(guān)鍵分子的表達(dá)情況;高/低表達(dá)lncRNAOHOTAIR肝癌細(xì)胞系中應(yīng)用western blot檢測(cè)GLUT1表達(dá)情況;應(yīng)用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HOTAIR與si-GLUT1，檢測(cè)GLUT1表達(dá)、肝癌細(xì)胞糖酵解情況；⑹高/低表達(dá)lncRNA-HOTAIR肝癌細(xì)胞系中western blot檢測(cè)p-mTOR表達(dá)情況;高表達(dá)lncRNA-HOTAIR肝癌細(xì)胞系中應(yīng)用雷帕霉素阻斷mTOR信號(hào)的

7、活性，應(yīng)用western blot檢測(cè)GLUT1的表達(dá)，應(yīng)用葡萄糖試劑盒及乳酸試劑盒檢測(cè)糖酵解情況;應(yīng)用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(RNA Binding ProteinImmunoprecipitation，RIP)驗(yàn)證lncRNA-HOTAIR與GLUT1的結(jié)合。
　　結(jié)果：①通過(guò)提取84例HCC患者腫瘤組織及癌旁組織的總RNA，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)lncRNA-HOTAIR在其中的表達(dá)情況，結(jié)果表明在總體上，l

8、ncRNA-HOTAIR在肝癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織;此外，我們分析了lncRNA-HOTAIR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明，lncRNA-HOTAIR與肝癌的腫瘤大小相關(guān)。②檢測(cè)了幾種不同的肝癌細(xì)胞系肝癌細(xì)胞系中，lncRNA-HOTAIR的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比而言，在這幾種肝癌細(xì)胞系中，lncRNA-HOTAIR的表達(dá)量均較為明顯的增高，在HepG2肝癌細(xì)胞系中，lncRNA-HOTAIR相對(duì)表達(dá)量最高，

9、而在Hep3B肝癌細(xì)胞系中，lncRNA-HOTAIR相對(duì)表達(dá)量最低。③為了評(píng)測(cè)lncRNA-HOTAIR對(duì)HCC細(xì)胞的增殖能力的影響，我們進(jìn)行CCK8增殖實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)lncRNA-HOTAIR對(duì)HCC細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細(xì)胞系中，細(xì)胞的增殖能力明顯提高;而與之相反的是，在降低了lncRNA-HOTAIR的HepG2肝癌細(xì)胞系中，細(xì)胞的增殖能力明顯降低。這說(shuō)明，lncRNA-HO

10、TAIR能夠提高HCC細(xì)胞的增殖能力。④分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細(xì)胞系以及降低了lncRNA-HOTAIR表達(dá)的HepG2肝癌細(xì)胞系中葡萄糖消耗與乳酸生成的情況，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細(xì)胞系組，與對(duì)照組相比，血清中葡萄糖的消耗與乳酸的生成明顯的增加;而與此相反的是，降低lncRNA-HOTAIR表達(dá)的HepG2肝癌細(xì)胞系組，與對(duì)照組相比，血清中葡萄糖的消耗與乳酸的生成明顯

11、的減少，這說(shuō)明lncRNA-HOTAIR能夠促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解的發(fā)生。⑤在過(guò)表達(dá)lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細(xì)胞系中檢測(cè)幾種關(guān)鍵酶mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA-HOTAIR促進(jìn)GLUT1的表達(dá)最為明顯;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明lncRNA-HOTAIR可以促進(jìn)GLUT1的表達(dá);以上結(jié)果表明，lncRNA-HOTAIR是通過(guò)調(diào)節(jié)GLUT1的方式從而調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的糖酵解的。⑥為探討lncRNA-HOTAIR調(diào)節(jié)GLU

12、T1的機(jī)制，我們檢測(cè)過(guò)表達(dá)lncRNA-HOTAIR的Hep3B肝癌細(xì)胞系及降低lncRNA-HOTAIR表達(dá)的HepG2肝癌細(xì)胞系中磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，降低lncRNA-HOTAIR表達(dá)導(dǎo)致p-mTOR蛋白表達(dá)降低;而與之相反的是，過(guò)表達(dá)lncRNA-HOTAIR導(dǎo)致p-mTOR蛋白表達(dá)升高。這說(shuō)明，lncRNA-HOTAIR能夠激活mTOR信號(hào)。此外，為了驗(yàn)證mTOR對(duì)糖酵解及其關(guān)鍵酶GLUT1的

13、調(diào)節(jié)，我們應(yīng)用mTOR抑制劑----雷帕霉素抑制mTOR的表達(dá)，然后檢測(cè)GLUT1的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著mTOR被抑制，GLUT1的表達(dá)也隨之降低;此外，隨著mTOR被抑制，葡萄糖消耗及乳酸生成也隨之減少，這說(shuō)明在HCC細(xì)胞中p-mTOR確實(shí)可以促進(jìn)其糖酵解，另一方面，為了探究lncRNA-HOTAIR是否也可以通過(guò)直接與GLUT1相結(jié)合從而促進(jìn)GLUT1的表達(dá)，我們進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，lncRNA-HOTAIR與GLUT1確實(shí)

14、可以相結(jié)合，這說(shuō)明，lncRNA-HOTAIR也可以通過(guò)直接靶向GLUT1從而調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的糖酵解。以上結(jié)果表明，lncRNA-HOTAIR可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR的活性及與GLUT1直接結(jié)合兩種方式促進(jìn)GLUT1表達(dá)，從而促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解。
　　結(jié)論：⑴肝癌組織中，lncRNA-HOTAIR呈高表達(dá)并與肝癌的腫瘤大小相關(guān)；⑵肝癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-HOTAIR呈高表達(dá)；⑶lncRNA-HOTAIR可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖；⑷L