長非編碼RNA ANRIL下調(diào)KLF2的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌（以下簡稱為肝癌）為肝癌的主要病理類型，其死亡率位居我國惡性腫瘤死因第二位，是嚴(yán)重影響我國居民健康的惡性疾病。關(guān)于其發(fā)病的分子機(jī)制，仍未完全闡明，研究表明眾多l(xiāng)ncRNAs在多種腫瘤包括肝癌中表達(dá)異常，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程改變、凋亡、以及侵襲遷移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。
　　lncRNA ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 Locus)定位于

2、9q21染色體上，是細(xì)胞周期激酶抑制子4b(INK4b)位點(diǎn)的反義非編碼RNA，它通過調(diào)節(jié)INK4b-ARF-INK4a抑制p15INK4b和p16INK4a等抑癌因子和激活Ras通路從而延緩細(xì)胞衰老以及促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展。研究表明ANRIL與胃癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，但其在肝癌中的表達(dá)情況及其具體的生物學(xué)功能尚不清楚，需進(jìn)一步研究。
　　本課題中，我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測77例肝癌患者癌組織

3、及癌旁組織中ANRIL的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平在肝癌組織中較癌旁組織顯著上調(diào)(P＜0.01)，結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，ANRIL的表達(dá)水平與肝癌患者的腫瘤大小(P＜0.01)、BCLC分期（P＜0.01)密切相關(guān)，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，ANRIL在肝癌細(xì)胞系（HepG2，Hep3B，MHCC-97H）中的表達(dá)較肝正常細(xì)胞系(L02)顯著上調(diào)(P＜0.01);MTT、克隆形成、transwell實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中干擾ANR

4、IL能抑制細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;定量PCR及Western blotting結(jié)果顯示KLF2 mRNA及蛋白的表達(dá)在干擾ANRIL后顯著上調(diào);核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ANRIL亞細(xì)胞定位主要位于核內(nèi)，RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ANRIL可以與SUZ12及EZH2結(jié)合，ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)EZH2及SUZ12可與KLF2啟動子區(qū)結(jié)合，提示KLF2可能是ANRIL下游的重要靶基因;進(jìn)一步干擾EZH2和SUZ12后KLF2表達(dá)水平顯著上調(diào);過表

5、達(dá)KLF2后發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞增殖及克隆形成能力明顯下降，并能阻滯肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程于G1期，同時(shí)也能明顯的促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ANRIL可能受到SP1調(diào)控，過表達(dá)及干擾SP1表達(dá)后ANRIL表達(dá)量隨之改變，ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SP1可與ANRIL的啟動子區(qū)結(jié)合。
　　綜上所述，本研究提示:肝癌中SP1促進(jìn)ANRIL的轉(zhuǎn)錄，并通過綁定PRC2復(fù)合物介導(dǎo)KIF2啟動子區(qū)的組蛋白H3K27三甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡