長鏈非編碼RNA在腎癌靶向治療耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　近年來，在世界范圍內(nèi)腎細胞癌(RCC)的發(fā)生率逐年上升。約20％的腎癌患者在疾病診斷時已經(jīng)發(fā)生腫瘤的進展轉(zhuǎn)移，而且近30％的局限性腎癌患者在腫瘤切除后會發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。隨著對腎癌發(fā)病機制的深入探索，受體酪氨酸激酶抑制劑被作為進展性腎癌患者的一線治療方案。舒尼替尼(Sunitinib，Sutent)是一種口服、多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑，可以抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、血小板源性生長因子受體(PDGFR)、

2、干細胞生長因子受體(KIT)等多種受體酪氨酸激酶的活性，因此，舒尼替尼具有抑制腫瘤血管和殺傷腫瘤細胞的雙重作用。但是約10-20％的進展性腎癌患者在初次治療時就對舒尼替尼先天耐藥，而其余的患者往往在接受舒尼替尼治療6-15個月后出現(xiàn)耐藥和疾病進展，這些現(xiàn)狀使得舒尼替尼并不能有效延長腎癌患者的生存期。許多研究提出信號轉(zhuǎn)導(dǎo)旁路的活化可能是腎癌舒尼替尼耐藥的潛在原因，然而其生物學(xué)機制尚待闡明。另一方面，目前尚缺乏預(yù)測舒尼替尼治療療效的生物學(xué)標(biāo)

3、志物。因此，探索腎癌舒尼替尼耐藥的生物學(xué)機制以及尋找預(yù)測舒尼替尼治療療效的生物學(xué)標(biāo)志物十分迫切。
　　近幾年，隨著二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，原本認為是基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”的長鏈非編碼RNA(lncRNA)被證明具有重要的生物學(xué)作用。lncRNA是一類長度大于200個堿基的轉(zhuǎn)錄本，其不編碼蛋白或者僅編碼很短的多肽。研究表明lncRNA可在多水平調(diào)節(jié)基因表達，包括參與染色質(zhì)印記，與表觀修飾復(fù)合物或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，與miRN

4、A、mRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等。越來越多的證據(jù)表明lncRNA參與調(diào)節(jié)腫瘤的多種生物學(xué)特性，包括增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、代謝等，然而lncRNA在腫瘤耐藥尤其是舒尼替尼耐藥中的作用尚未見報道。
　　因此，本課題的研究目的是探討lncRNA在腎癌舒尼替尼耐藥中的生物學(xué)作用及分子機制，為舒尼替尼抵抗的腎癌患者提供新的聯(lián)合治療靶點，并且尋找可預(yù)測腎癌舒尼替尼治療反應(yīng)性的組織學(xué)和血清學(xué)標(biāo)志物，為腎癌的個性化治療提供重要參考。

5、r>　　研究方法:
　　1.利用裸鼠皮下荷瘤模型和體內(nèi)連續(xù)傳代方法構(gòu)建舒尼替尼耐藥的腎癌細胞系。
　　2.利用lncRNA表達譜芯片篩選舒尼替尼耐藥的腎癌細胞系和親本細胞系中差異表達的lncRNA。
　　3.利用腎癌臨床樣本以及患者移植瘤樣本對lncRNA表達水平進行篩選。
　　4.利用RNAi方法從上述lncRNA中篩選出對耐藥細胞具有增敏作用的lncRNA進行后續(xù)研究。
　　5.利用5'RACE和3'R

6、ACE技術(shù)克隆lncARSR轉(zhuǎn)錄本的全長，并利用生物信息學(xué)(PhyloC SF、ORF-finder、CPAT)分析lncARSR的非編碼特性。
　　6.根據(jù)5'RACE結(jié)果，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測lncARSR的啟動子區(qū)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子FOXO，利用ChIP-qPCR驗證FOXO對lncARSR啟動子區(qū)的結(jié)合。
　　7.利用Ambion公司的mirVana(@) PARIS(@)試劑盒抽取腎癌患者血漿中的RNA，利用Re

7、altime PCR和PCR產(chǎn)物測序確定血漿中l(wèi)ncARSR的存在。
　　8.利用腎癌患者接受舒尼替尼治療前及治療過程中的血樣，分析血漿中l(wèi)ncARSR水平與腎癌患者舒尼替尼反應(yīng)性和無進展生存期的相關(guān)性，多因素分析評判l(wèi)ncARSR作為患者預(yù)后判定的獨立風(fēng)險因素的可能性。
　　9.利用腎癌患者接受舒尼替尼治療前的腫瘤組織樣本，通過RNA原位雜交檢測組織中l(wèi)ncARSR表達水平，分析組織中l(wèi)ncARSR水平與腎癌患者舒尼替尼反

8、應(yīng)性和無進展生存期的相關(guān)性，多因素分析評判l(wèi)ncARSR作為患者預(yù)后判定的獨立風(fēng)險因素的可能性。
　　10.利用超高速離心的方法抽提細胞培養(yǎng)上清中的外泌體，檢測不同細胞來源的外泌體中l(wèi)ncARSR的表達量。
　　11.利用RNA pull-down、RIP實驗，研究lncARSR進入外泌體的機制。
　　12.通過共培養(yǎng)、外泌體孵育、外泌體瘤內(nèi)注射等研究外泌體傳播舒尼替尼耐藥的作用。
　　13.利用慢病毒介導(dǎo)的ln

9、cARSR過表達腎癌細胞系，研究lncARSR對腎癌敏感細胞的舒尼替尼反應(yīng)性的影響。
　　14.利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA敲低腎癌耐藥細胞系中l(wèi)ncARSR的表達，研究lncARSR對耐藥細胞的舒尼替尼敏感性的影響。
　　15.利用Western blot篩選表達受lncARSR調(diào)控的受體酪氨酸激酶，并在臨床樣本中進一步驗證。
　　16.利用Rescue方法，證明AXL與c-MET介導(dǎo)了lncARSR促進舒尼替尼耐藥性

10、的作用。
　　17.利用生物信息學(xué)預(yù)測lncARSR與AXL/c-MET共有的miR-34/449結(jié)合序列，通過MS2-RIP實驗、報告基因以及Western blot研究lncARSR對miRNA-34/449的競爭性結(jié)合作用。
　　18.利用裸鼠腎原位和皮下荷瘤模型，研究特異性靶向lncARSR的鎖核酸(LNA)或AXL/c-MET抑制劑對腎癌耐藥移植瘤的舒尼替尼反應(yīng)性的作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.腎癌舒

11、尼替尼耐藥細胞與敏感細胞的lncRNA表達譜存在顯著差異。
　　2.通過腎癌臨床樣本、患者移植瘤樣本及RNAi功能實驗篩選出一條在腎癌耐藥細胞高表達且有功能的lncRNA，命名為lncARSR(lncRNA Activated in RCC withSunitinib Resistance)。
　　3.與治療前腎癌組織相比，舒尼替尼治療后耐藥復(fù)發(fā)的組織中l(wèi)ncARSR表達升高。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和FOXO3a

12、通過招募組蛋白去乙?；敢种苐ncARSR的轉(zhuǎn)錄。
　　5.腎癌患者血漿中可檢測到lncARSR，且舒尼替尼耐藥患者的血漿中l(wèi)ncARSR水平更高。
　　6.接受舒尼替尼治療后腎癌患者血漿中l(wèi)ncARSR高表達組患者的無進展生存期低于lncARSR低表達組，且血漿lncARSR可作為患者預(yù)后的獨立風(fēng)險因素。
　　7.腫瘤組織中l(wèi)ncARSR低表達組患者對舒尼替尼治療敏感，而lncARSR高表達組患者對舒尼替尼治療不敏感

13、。并且在lncARSR低表達組，舒尼替尼治療與患者的更好預(yù)后具有相關(guān)性。
　　8.hnRNPA2B1參與調(diào)控lncARSR進入外泌體。
　　9.耐藥細胞通過外泌體介導(dǎo)lncARSR在細胞間的傳遞，促進舒尼替尼耐藥表型的播散。
　　10.過表達lncARSR可提高腎癌敏感細胞對舒尼替尼的耐藥性。
　　11.敲低lncARSR表達可恢復(fù)腎癌耐藥細胞對舒尼替尼的敏感性。
　　12.lncARSR通過促進AXL與c

14、-MET的表達促進腎癌細胞舒尼替尼耐藥。
　　13.lncARSR作為ceRNA競爭性結(jié)合miRNA-34/449家族，拮抗miRNA-34/449對AXL和c-MET的抑制作用，促進AXL和c-MET的表達。
　　14.特異性靶向lncARSR的鎖核酸或AXL/c-MET抑制劑可以增加耐藥移植瘤對舒尼替尼的敏感性。
　　研究結(jié)論：
　　本研究通過lncRNA表達譜芯片、臨床樣本和功能實驗篩選出一條在腎癌舒尼替尼

15、耐藥細胞中高表達且有功能的新的lncRNA，命名為lncARSR。lncARSR可通過外泌體從耐藥細胞傳遞至周圍細胞，促進耐藥表型的播散。臨床研究表明腫瘤組織和血漿中l(wèi)ncARSR高表達的腎癌患者對舒尼替尼治療反應(yīng)性差。機制研究表明，lncARSR作為ceRNA競爭性結(jié)合miRNA-34和miRNA-449家族，拮抗miRNA-34/449對AXL和c-MET的抑制作用，促進AXL和c-MET表達及下游STAT3、AKT、ERK信號通路