長鏈非編碼RNa-ATB在HCV相關纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：長鏈非編碼RNA-ATB在HCV相關肝纖維化患者血漿及肝組織的表達變化
　　目的:
　　明確lncRNA-ATB在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)相關肝纖維化患者血漿及肝組織的表達變化，分析血漿lncRNA-ATB作為生物學標記對HCV相關肝纖維化的診斷價值。
　　方法:
　　采用隨機對照研究，選擇2014年9月至2015年6月在河北

2、醫(yī)科大學第三醫(yī)院門診及住院的慢性HCV感染者36例，并選擇15例健康體檢者作為健康對照。留取外周靜脈血，分別分離血漿、血清，儲存于-80℃冰箱備用。HCV感染患者均進行肝穿刺活檢術及肝組織病理檢查，根據(jù)METAVIR評分系統(tǒng)將HCV患者分為輕度纖維化組(F＜2;n=14)和中至重度纖維化組(2≤F＜4; n=22)。另選5例肝移植供體作為健康對照組。血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天門冬

3、氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平采用酶法檢測;肝組織切片行蘇木素-伊紅（Haematoxylin and eosin，HE）染色及Masson三色染色，觀察肝組織脂肪變性、炎癥及纖維化程度;免疫組織化學染色方法評估肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原α1(alpha-1 typeⅠ collagen，Col1A1)表達;原位雜交方法

4、檢測肝組織lncRNA-ATB表達;采用Trizol LS提取血漿總RNA，以實時熒光定量PCR方法檢測血漿lncRNA-ATB表達。
　　結果:
　　1.患者一般情況:健康對照組(n=15)，其中男性8例(53.3％)，女性7例(46.7％)，平均年齡（51.2±11.4）歲;HCV感染患者F＜2組(n=14)，其中男性6例(42.9％)，女性8例(57.1％)，平均年齡(48.8±11.6)歲;HCV感染患者2≤F＜4組

5、(n=22)，其中男性12例(54.5％)，女性10例(45.5％)，平均年齡（52.5±7.2）歲。三組年齡之間差異無統(tǒng)計學意義(F=0.596，p=0.555)。
　　2.血清ALT、AST水平:健康對照組、HCV感染患者F＜2組及HCV感染患者2≤F＜4組血清ALT中位數(shù)分別為17.0、33.0、50.0 U/L，三組之間差異具有統(tǒng)計學意義（x2=23.79，p=0.000）;血清AST中位數(shù)分別為15.0、32.0、43.

6、5U/L，三組之間差異具有統(tǒng)計學意義(x2=23.33，p=0.000)。
　　結論:
　　1.肝組織病理學顯示HCV感染患者肝臟炎癥及纖維化增加，伴隨lncRNA-ATB表達上調(diào)。
　　2.血漿lncRNA-ATB表達在HCV感染患者中顯著升高，并在中至重度肝纖維化患者中進一步升高。并且血漿lncRNA-ATB水平與HCV相關肝纖維化分期呈正相關。
　　3.血漿lncRNA-ATB對HCV相關肝纖維化程度具有重

7、要的診斷價值，有望成為診斷HCV相關肝纖維化的新型生物學標記。
　　第二部分：
　　長鏈非編碼RNA-ATB在體外活化的肝星狀細胞中的表達變化
　　目的:
　　建立穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的HepG2-CORE細胞系，探明lncRNA-ATB在HSC活化中的作用。
　　方法:
　　轉染pcDNA3.1-HCV核心蛋白質粒至HepG2細胞，篩選穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的HepG2-CORE細胞系并進行驗證;

8、進一步應用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）轉染HepG2-CORE細胞以敲除轉化生長因子(transforming growth factor，TGFβ)1。實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測HCV core表達;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1水平。將細胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基處理人肝

9、星狀細胞系LX-2，同時應用重組人TGFβ1按劑量梯度及時間梯度處理LX-2細胞。實時熒光定量PCR、Western blot及免疫細胞熒光染色方法檢測α-SMA、Col1A1表達;細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8）檢測細胞增殖情況;實時熒光定量PCR檢測lncRNA-ATB表達變化。
　　結果:
　　1.穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的HepG2-CORE細胞系建立成功:HepG2-CO

10、RE細胞與對照HepG2-NC細胞相比，能夠穩(wěn)定表達HCV coremRNA和蛋白;培養(yǎng)上清液中TGFβ1水平顯著升高。si-TGFβ1-1能明顯減少HepG2-CORE細胞TGFβ1 mRNA表達，并降低細胞培養(yǎng)上清中TGFβ1水平。
　　2.HepG2-CORE細胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基促進HSC活化:HepG2-CORE細胞培養(yǎng)上清液促進LX-2細胞α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表達顯著增加，與之相比，si-TGF

11、β1-1轉染后的HepG2-CORE細胞培養(yǎng)上清液引起LX-2細胞α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表達程度下降。
　　結論:
　　1.穩(wěn)定表達HCV核心蛋白的HepG2-CORE細胞上清液可作為條件培養(yǎng)基促進LX-2細胞活化;
　　2.敲除HepG2-CORE細胞中TGFβ1表達，減少細胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1水平，并減少LX-2細胞活化;
　　3.重組人TGFβ1以劑量及時間依賴方式促進細胞活化及增殖;

12、
　　4.LncRNA-ATB可能為HSC活化的重要分子標志。
　　第三部分：長鏈非編碼RNA-ATB的競爭性內(nèi)源RNA分子調(diào)控機制預測及驗證
　　目的:
　　預測并驗證lncRNA-ATB作為競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控相關miRNA靶基因的分子機制。
　　方法:
　　采用分子生物信息學分析預測lncRNA-ATB相關miRNA及其靶基因，構建lncRNA-ATB及靶基因3'-非翻譯區(qū)(untranslat

13、ed regions，UTR)野生型及突變型雙熒光素酶報告載體質粒，與miRNA模擬物(mimics)共轉染，定量檢測雙熒光素酶催化產(chǎn)生的熒光數(shù)值，驗證miRNA的作用靶點。應用miRNA mimics、抑制劑(inhibitor)以及相應對照轉染LX-2細胞，48h后收集細胞，采用實時熒光定量PCR檢測lncRNA-ATB、miRNA及α-SMA、Col1A1 mRNA表達變化;Western blot方法檢測α-SMA、Col1A1

14、蛋白表達變化。
　　結果:
　　1.分子生物信息學預測lncRNA-ATB相關的miRNA及其靶基因:lncRNA-ATB與Ⅱ型TGF-β受體（TGF-β typeⅡ receptor，TGF-βRⅡ）和SMAD2具有相同的miRNA-425-5p結合位點(CACAGUA)。
　　2.雙熒光素酶報告基因驗證miRNA-425-5p與lncRNA-ATB及靶基因結合:結果顯示miRNA-425-5p mimics可顯著下

15、調(diào)psi-ATB-wt、psi-TGF-βRⅡ-wt、psi-SMAD2-wt依賴的熒光素酶活性。
　　結論:
　　1.生物信息學預測及雙熒光素酶報告基因檢測證實lncRNA-ATB與TGF-βRⅡ和SMAD2具有相同的miR-425-5p結合位點。
　　2.靶向調(diào)控miR-425-5p表達引起LX-2細胞內(nèi)源性miR-425-5p表達變化，并能通過轉錄抑制TGF-βRⅡ、SMAD2蛋白表達及調(diào)節(jié)α-SMA、Col1A

16、1 mRNA及蛋白表達變化。
　　第四部分：靶向調(diào)控長鏈非編碼RNA-ATB對肝星狀細胞活化的作用及分子機制
　　目的:
　　明確過表達及敲除lncRNA-ATB對HSC活化的影響及潛在的分子生物學機制。
　　方法:
　　構建lncRNA-ATB過表達質粒轉染LX-2細胞，通過實時熒光定量PCR、Western blot方法檢測α-SMA、Col1A1、TGF-βRⅡ和SMAD2表達;LX-2細胞增殖通過C

17、CK-8試劑盒檢測;免疫熒光細胞化學染色檢測TGF-βRⅡ和SMAD2表達;實時熒光定量PCR檢測lncRNA-ATB、miR-425-5p表達變化。
　　結果:
　　LncRNA-ATB促進LX-2細胞活化:過表達lncRNA-ATB可增加LX-2細胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表達，并促進LX-2細胞增殖。
　　結論:
　　1.過表達lncRNA-ATB可通過降低內(nèi)源性miR-425-5p上調(diào)TG