長鏈非編碼RNA-n346372在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)基因研究.pdf

1、目的:
　　1.基于全轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果，篩選在膀胱癌組織與癌旁組織中顯著差異表達(dá)的lncRNA分子;
　　2.驗證lncRNA-n346372在膀胱癌組織與癌旁組織，膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異情況，以及與患者臨床病理信息的相關(guān)性;
　　3.探討lncRNA-n346372在膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)功能中的作用;
　　4.進(jìn)一步分析驗證lncRNA-n346372與mRNA Cyclin B1的相

2、關(guān)性，預(yù)測可能涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　方法:
　　1.通過新一代測序技術(shù)，對10對膀胱癌組織/癌旁組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組高通量測序，采用Wilcoxon rank sum test、DESeq2、EdgeR等統(tǒng)計學(xué)分析方法，以p＜0.05、fdr＜0.05、log2FoldChange＞2為篩選策略，對測序結(jié)果中差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行再次篩選，為后續(xù)驗證縮小范圍;
　　2.提取40對膀胱癌/癌旁組織，及5個不同惡性程度的膀

3、胱癌細(xì)胞系中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Real Time qPCR技術(shù)和FISH技術(shù)對上述篩選結(jié)果中l(wèi)ncRNAn346372的表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步組織和細(xì)胞水平的驗證，同時對不同腫瘤級別中l(wèi)ncRNAn346372中的表達(dá)量進(jìn)行t test比較分析，明確其相關(guān)性;
　　3.分別構(gòu)建lncRNA-n346372 shRNA T24慢病毒及過表達(dá)5637穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，通過CCK-8，小室，流式等實驗技術(shù)，觀察不同處理組相對對照組細(xì)

4、胞功能變化情況;
　　4.在高通量測序發(fā)現(xiàn)的眾多差異表達(dá)lncRNA及mRNA的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)的相關(guān)性分析，預(yù)測可能與lncRNA-n346372相關(guān)的mRNA分子，進(jìn)一步通過RealTime qPCR，免疫組化，Weston Blot等技術(shù)驗證兩者在組織和細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性，為后續(xù)功能相關(guān)性以及調(diào)控機(jī)制研究提供前提依據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.按照上述策略，共篩選出32條log2FoldChange＞2的ln

5、cRNAs，其中差異倍數(shù)＞3的lncRNAs共9條，lncRNA-n346372 T/N的差異倍數(shù)最高，為3.96倍;Tumor組的相對表達(dá)量平均值為4.29，Normal組為0.20;
　　2.40對組織中有18對膀胱癌組織大于癌旁組織，腫瘤組的表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.05)，并在FISH實驗中得以證實。在高級別腫瘤組織中的表達(dá)高于低級別腫瘤組織(P＜0.05)。在T24(高侵襲性)膀胱癌細(xì)胞株的表達(dá)量顯著高于5637（低

6、侵襲性）膀胱癌細(xì)胞系;
　　3.成功構(gòu)建干擾/過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞株，干擾T24膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的lncRNA-n346372表達(dá)后后，其增殖能力、遷移及侵襲能力受到抑制，而過表達(dá)后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力顯著增強(qiáng)。
　　4.生物信息學(xué)相關(guān)性分析顯示lncRNA-n346372與細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1具有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，相關(guān)系數(shù)r=0.76。并在組織核酸水平的驗證中得以證實，而且免疫組化、Weston Blo

7、t實驗發(fā)現(xiàn)Cyclin B1在膀胱癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織。干擾lncRNA-n346372的細(xì)胞株的Cyclin B1的表達(dá)量顯著低于對照組。
　　結(jié)論:
　　1.LncRNA-n346372在膀胱癌組織的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，病理級別越高lncRNA-n346372的表達(dá)量越高，與惡性表型存在顯著相關(guān)性。
　　2.LncRNA-n346372參與膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等功能
　　3.LncRNA-