長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在食管癌發(fā)生發(fā)展中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、食管癌是世界上常見的惡性腫瘤，已經(jīng)成為全球死亡的主要原因之一，且發(fā)病有明顯的地域和組織學(xué)類型上的差異。上皮來源的食管癌有兩種主要病理類型:食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌。在中國(guó)，食管鱗狀細(xì)胞癌是食管癌的主要病理類型，大約占總數(shù)的90％以上。盡管食管癌診斷及治療已有較大的進(jìn)展，但是食管癌預(yù)后仍較差，總體5年生存率仍然處于較低的水平。其主要原因是缺乏有效的早期食管癌檢測(cè)方法及進(jìn)行合理的規(guī)范化治療。因此，如何篩選出更多有效的腫瘤標(biāo)志物及尋找食管癌治

2、療的潛在靶點(diǎn)已成為目前基礎(chǔ)和臨床研究的主要方向。
　　人類基因組中只有不到2％的序列為蛋白質(zhì)編碼，其他序列雖然不編碼蛋白質(zhì)，但超過90％能被轉(zhuǎn)錄成RNA。這些不能為蛋白質(zhì)編碼的RNA分子統(tǒng)稱為非編碼RNA。非編碼RNA參與了多種生物學(xué)過程，并在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。非編碼RNA基于規(guī)模大致分為兩大類:短鏈非編碼RNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA。作為非編碼RNA中的新角色，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在各種疾病尤其是腫瘤中起重要調(diào)控作用，成為腫瘤

3、研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在多種層面上（表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后調(diào)水平）調(diào)控基因的表達(dá)。大量證據(jù)表明多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA在多類腫瘤中存在異常表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著促癌或抑癌作用。HOX轉(zhuǎn)錄RNA(HOTAIR)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性乳腺癌中具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的長(zhǎng)鏈非編RNA。近年來，越來越多的研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此，探索腫瘤相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA以及與

4、蛋白編碼基因之間的相互關(guān)系已經(jīng)成為腫瘤生物研究領(lǐng)域的重要課題。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19作為印記基因的非編碼轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)物，其父源印記母系等位基因表達(dá)，不具編碼蛋白能力。新近研究表明，H19位點(diǎn)缺失導(dǎo)致其在膀胱癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)較高豐度的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其具有原癌活性。但也有研究認(rèn)為H19具有抑癌活性，可以抑制腫瘤的惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和腫瘤新生血管的形成。更加引人關(guān)注的是H19有望成為臨床早期診斷和預(yù)后判斷新的標(biāo)志物，

5、也為腫瘤的治療提供了一種新的思路。
　　目的:
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在食管癌中的生物學(xué)功能以及病理學(xué)機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討H19在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集本科室2007-2012年行腫瘤切除術(shù)的64例食管癌患者的組織標(biāo)本，采用qRT-PCR的方法，定量檢測(cè)了H19在64對(duì)食管癌組織及對(duì)應(yīng)的正常食管組織中的表達(dá)水平，并分析H19的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)

6、性。
　　2.采用qRT-PCR的方法檢測(cè)H19在正常食管上皮細(xì)胞株Het-1A及食管癌細(xì)胞株EC109，EC9706，KYSE150和KYSE450中的表達(dá)水平，選擇明顯高表達(dá)的食管癌細(xì)胞株作為進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行后續(xù)功能研究。
　　3.通過siRNA干擾技術(shù)沉默H19在食管癌細(xì)胞株EC109、EC9706中的表達(dá)水平，并通過CCK-8法、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、裸鼠原位成瘤實(shí)驗(yàn)、transwell細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H19表達(dá)

7、干擾后對(duì)食管癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)、遷移、侵襲等腫瘤細(xì)胞學(xué)行為的影響。
　　4.經(jīng)Western blot法分析H19沉默對(duì)EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物vimentin及其MMPs家族中MMP-9蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19在食管癌組織的表達(dá)水平均明顯高于癌旁正常組織;在食管癌的發(fā)生、發(fā)展中可能擔(dān)當(dāng)重要的角色。其表達(dá)與患者腫瘤的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與年齡、性別與腫瘤

8、分化程度無關(guān)。
　　2.本研究通過對(duì)4種食管癌細(xì)胞株及正常上皮細(xì)胞株中H19的檢測(cè)，證實(shí)H19在食管癌細(xì)胞株里的表達(dá)水平也明顯高于食管正常上皮細(xì)胞株。食管癌細(xì)胞株EC109及EC9706明顯高表達(dá)H19，可以作為進(jìn)一步研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　3.通過siRNA干擾技術(shù)沉默H19在食管癌細(xì)胞株EC109、EC9706中的表達(dá)水平后，CCK-8法檢測(cè)H19表達(dá)下調(diào)后可顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)H19表達(dá)干擾后食管

9、癌細(xì)胞株發(fā)生G0/G1期阻滯。為了進(jìn)一步探討H19在體內(nèi)的促癌生長(zhǎng)作用，我們利用H19干擾EC9706細(xì)胞株及陰性對(duì)照組進(jìn)行了裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)H19干擾細(xì)胞株在裸鼠皮下的成瘤能力明顯受到抑制，其腫瘤體積及重量均明顯低于陰性對(duì)照組。我們進(jìn)一步采用Transwell小室研究了H19表達(dá)干擾細(xì)胞株EC109和EC9706的遷移和侵襲能力，結(jié)果表明，H19表達(dá)干擾細(xì)胞株的遷移和侵襲能力較對(duì)照組明顯抑制。
　　4.Western bl

10、ot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，抑制H19表達(dá)后，食管癌細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平明顯增高，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin及MMP-9蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　綜上所述，本研究顯示長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在食管癌組織中表達(dá)上調(diào)，在食管癌中作為促癌基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。其分子機(jī)制可能通過介導(dǎo)EMT的發(fā)生促進(jìn)食管癌侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制H19的表達(dá)能夠阻滯EMT的發(fā)生。長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19在食