基于GWAS的非編碼RNA參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。全球范圍內(nèi)，胃癌位列全部腫瘤發(fā)病率第五位，死亡率第三位。在中國，胃癌發(fā)病率和死亡率均占消化系統(tǒng)腫瘤首位，男女發(fā)病比例約為2∶1，給我國帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)壓力。由于胃癌發(fā)病隱匿，且缺乏早期臨床特征，大部分患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期;加之目前尚缺乏根治性治療方案，胃癌患者易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后生存效果不佳。因此，加強(qiáng)胃癌病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制研究，篩選高效、特異、敏感的生物標(biāo)志物用于胃癌的預(yù)防和治療，顯得尤為重

2、要和迫切。
　　大量流行病資料顯示，胃癌發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素參與的多階段逐步演變的過程，是環(huán)境因素、生物因素以及遺傳因素、表觀遺傳因素等共同作用的結(jié)果。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，遺傳易感性研究策略為探討腫瘤病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制提供新的思路。全基因組關(guān)聯(lián)性研究(genome-wide association study，GWAS)作為研究腫瘤易感基因的重要手段，發(fā)現(xiàn)PLCE1、MUC1和PSCA等眾多易感基因參與了胃癌發(fā)病過程，為胃癌病因?qū)W

3、研究提供重要線索。
　　然而，鑒于GWAS芯片“標(biāo)簽位點(diǎn)”設(shè)計(jì)特點(diǎn)以及單個(gè)位點(diǎn)分析策略，GWAS發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)僅能解釋較小部分的遺傳度，掩蓋了大量可能具有顯著胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)指示作用的易感位點(diǎn)?！昂驡WAS”研究策略的提出是對GWAS的一項(xiàng)重要補(bǔ)充措施。精細(xì)作圖分析、生物信息學(xué)分析、功能學(xué)注釋以及細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等作為“后GWAS”主要研究方案，不僅彌補(bǔ)了缺失的遺傳信息，而且從生物學(xué)角度闡釋了易感基因及位點(diǎn)參與腫瘤發(fā)病的作用機(jī)制。<

4、br>　　本研究將基于“后GWAS”研究策略，根據(jù)基因遺傳變異分布特征，采用基因集分析(gene-set analysis)，深入挖掘胃癌GWAS數(shù)據(jù);采用多階段、多種族人群病例-對照研究設(shè)計(jì)，進(jìn)一步明確胃癌易感位點(diǎn);結(jié)合生物信息學(xué)分析、公用數(shù)據(jù)庫分析以及一系列細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)體系，系統(tǒng)揭示胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的可能生物學(xué)機(jī)制。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 基于GWAS的非編碼RNA遺傳變異與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究

5、
　　目前，尚未見基于基因類型開展遺傳變異分布特征注釋的研究報(bào)道。在本研究開展前期，我們基于GENCODE基因注釋庫，對來源1000 Genomes計(jì)劃的全基因組遺傳變異位點(diǎn)、GWAS catalog的腫瘤易感位點(diǎn)以及胃癌高度相關(guān)易感位點(diǎn)進(jìn)行分布特征注釋，發(fā)現(xiàn)雖然全基因水平上的基因間“荒漠區(qū)”位點(diǎn)所占比例最大，但腫瘤易感相關(guān)位點(diǎn)的分布逐漸向蛋白編碼與ncRNA聯(lián)合基因（簡稱:聯(lián)合基因）偏移，尤其在胃癌中，聯(lián)合基因上易感位點(diǎn)所占比例

6、已高達(dá)62.1％。我們推測，聯(lián)合基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要生物學(xué)調(diào)控作用。
　　基于上述科研假說，我們對胃癌GWAS數(shù)據(jù)按照蛋白編碼基因、ncRNA基因、聯(lián)合基因以及基因間分布進(jìn)行基因集分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合基因上位點(diǎn)集合效應(yīng)與胃癌易感相關(guān)性最為顯著(p=1.14×10-24)。該結(jié)果再次提示聯(lián)合基因與胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，為胃癌病因?qū)W研究提供思路。
　　為進(jìn)一步確定聯(lián)合基因集中的胃癌易感基因，我們在以各基因?yàn)閱挝坏幕?/p>

7、集分析中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新型的胃癌易感基因GCLET(gastric cancer low-expressedtranscript)。通過功能學(xué)注釋、獨(dú)立效應(yīng)分析、自然進(jìn)化選擇分析以及多階段、多種族人群（亞洲人種:共5，332病例、6，452對照;歐美人種:254病例、2，835對照）的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)具有潛在生物學(xué)效應(yīng)的GCLET rs3850997 T＞G位點(diǎn)可顯著降低胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.87，Pmeta=5.34×10-7)。隨后，

8、我們通過胃癌組織學(xué)驗(yàn)證以及報(bào)告基因、EMSA和ChIP等細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討rs3850997可能具有的等位基因特異性轉(zhuǎn)錄活性。研究發(fā)現(xiàn)，G等位基因能夠降低抑制性轉(zhuǎn)錄因子CTCF的親和力，進(jìn)而促進(jìn)GCLET基因轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)對胃癌易感的保護(hù)效應(yīng)。
　　本研究是首次對胃癌GWAS開展的基因集分析，為“后GWAS”時(shí)代的研究提供重要方法借鑒和數(shù)據(jù)參考，并為易感位點(diǎn)的遺傳調(diào)控機(jī)制研究提供重要思路和線索。
　　第二部分 lnc

9、RNA GCLET參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究
　　大量研究結(jié)果表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）作為表觀遺傳學(xué)中重要組成部分，參與了細(xì)胞生長、分化等生理過程以及包括惡性腫瘤在內(nèi)的復(fù)雜疾病的病理過程。本部分對第一部分關(guān)聯(lián)性研究定位的易感基因lncRNA GCLET開展深入的分子作用機(jī)制研究以探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程的重要調(diào)控作用。
　　結(jié)合臨床流行病學(xué)資料，分析GCLET與臨床表型

10、相關(guān)性;并觀察GCLET對細(xì)胞惡性表型的影響。此外，通過報(bào)告基因、細(xì)胞干擾和Western blot等細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，以及胃癌組織學(xué)驗(yàn)證，檢測胞質(zhì)中高豐度lncRNAGCLET是否具有“海綿”樣作用吸附miRNAs，發(fā)揮“競爭內(nèi)源性RNA(competingendogenous RNA，ceRNA)”效應(yīng)。
　　研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GCLET對胃癌細(xì)胞惡性增殖、侵襲和遷移具有顯著抑制效應(yīng)，進(jìn)而參與了胃癌病程進(jìn)展（浸潤深度P

11、trend=0.037;淋巴轉(zhuǎn)移Ptrend=0.019;臨床分期Ptrend=0.003）以及預(yù)后轉(zhuǎn)歸（logrank P=0.005）。生物信息學(xué)分析和細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GCLET可競爭性結(jié)合miR-27a-3p，抑制其對下游靶基因FOXP2的翻譯活性，形成“GCLET-miR-27a-3p-FOXP2”作用通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展。
　　本部分研究所開展的臨床表型與細(xì)胞表型結(jié)果相輔相成，互為驗(yàn)證，為GCLET作為臨床治療效