URG4的表達及其促進胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制研究.pdf

1、[背景]
　　胃癌是嚴重威脅國人健康的惡性腫瘤之一。目前對于胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制并不完全清楚，在一定程度上嚴重影響了胃癌治療的發(fā)展。胃癌的發(fā)生是一個多階段過程，整個過程中又伴隨著遺傳和后天基因改變的累積，其中以癌基因和抑癌基因的改變最為重要。對胃癌分子基礎(chǔ)的進一步認識有利于胃癌診斷、治療和預防新策略的建立。參與胃癌發(fā)生的有些分子可能成為有用的治療靶點。URG4（Upregulatedgene4）為我科劉杰教授利用消減雜交及差異

2、PCR技術(shù)篩選出的新分子，該基因能明顯促進肝癌發(fā)生，具有癌基因樣作用，可能是一個候選的癌基因。通過生物信息學等方法分析提示URG4可能在胃癌的發(fā)生中起著重要作用。迄今為止，URG4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制尚未見報道。為此，在前期工作基礎(chǔ)上，我們開展了URG4基因在胃癌中作用的相關(guān)研究。
　　[目的]
　　探討URG4在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機制，以期更全面的開發(fā)新基因的功能，闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的機制，并為尋找新的胃癌

3、治療策略提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　1、通過免疫組化方法檢測URG4及PCNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達分布，并分析其表達的意義及相關(guān)性。2、利用RT-PCR和Westernblot檢測URG4在胃癌細胞系（SGC7901、MKN28、MKN45、AGS和BGC823）以及永生化胃粘膜細胞GES中的表達。3、通過脂質(zhì)體法將URG4基因的真核表達載體轉(zhuǎn)入GES細胞、將URG4特異siRNA載體轉(zhuǎn)染入胃癌MKN28和SG

4、C7901細胞中，G418篩選抗性細胞克隆。4、利用RT-PCR和Westernblot鑒定和檢測URG4在轉(zhuǎn)染細胞系及親本對照細胞中的表達。5、通過MTT法繪制轉(zhuǎn)染細胞及其對照細胞的生長曲線。6、通過流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染細胞及其對照細胞的細胞周期分布。7、平板克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染細胞及對照細胞的克隆形成能力。8、軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測抑制URG4表達后，胃癌細胞體內(nèi)外成瘤能力的變化。9、Westernblot檢測轉(zhuǎn)染細

5、胞和對照細胞中細胞周期相關(guān)分子CyclinD1的變化。10、通過URG4誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化實驗檢測URG4對NIH3T3細胞生物學特性的影響。
　　[結(jié)果]
　　1、URG4在胃癌組織中表達的陽性率是65％，顯著高于癌旁組織（30％，P<0.001），并且URG4在高分化和中分化胃癌組織中的表達較低分化胃癌組織明顯增高(P均<0.01)；高表達URG4的胃癌組織中PCNA指數(shù)是64.04±11.56，而低表達URG4的

6、胃癌組織為49.84±9.68（P<0.001）。2、成功構(gòu)建了URG4正義表達載體和siRNA載體URG4-siRNA1、2、3，測序結(jié)果顯示序列正確。3、脂質(zhì)體法將載體轉(zhuǎn)染細胞，G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系GES-pcDNA3-URG4、MKN28-siRNA1,2,3和SGC7901-siRNA1,2,3；Westernblot結(jié)果顯示GES-pcDNA3-URG4細胞較對照GES-pcDNA3細胞URG4表達明顯增高，而MKN2

7、8-siRNA1,2,3、和SGC7901-siRNA1,2,3細胞分別較空載體對照MKN28-pSilencer、SGC7901-pSilencer細胞URG4表達明顯降低；其中以URG4-siRNA2抑制URG4表達的效果最為明顯。4、GES-pcDNA3-URG4細胞較GES-pcDNA3細胞生長速度明顯加快（P<0.05），而MKN28-siRNA1,2,3、和SGC7901-siRNA1,2,3細胞分別較空載體對照MKN28-

8、pSilencer、SGC7901-pSilencer細胞生長速度明顯受到抑制(P<0.05)。5、GES-pcDNA3-URG4由G1期進入S期的比例為49.6％，較GES-pcDNA3細胞23.5％明顯增多（P<0.01），而MKN28-siRNA1,2,3進入S期的比例分別為20.6％、18.9％、17.9％較MKN28-pSilencer細胞35.8％明顯減少（P<0.01），SGC7901-siRNA1,2,3進入S期的比例為

9、23.5％、19.3％、24.2％，較SGC7901-pSilencer細胞44.9％明顯減少（P<0.01）。6、MKN28-siRNA2細胞在平板內(nèi)形成克隆數(shù)（40.7±4.0個），較MKN28-pSilencer細胞（89.3±9.1個）明顯減少（P<0.01），SGC7901-siRNA2細胞在平板內(nèi)形成克隆數(shù)為38.7±4.1個，較SGC7901-pSilencer114.0±7.9個明顯減少（P<0.01）。7、MKN28-

10、siRNA1,2,3細胞在軟瓊脂上生長并分別形成集落數(shù)為7.5±1.81、4.25±1.89、6.5±2.51個，較MKN28-pSilencer細胞21.5±3.41個明顯減少（P<0.01）、SGC7901-siRNA1,2,3細胞在軟瓊脂上生長并分別形成集落數(shù)為12±1.63、6±1.12、7.75±1.26個，較SGC7901-pSilencer細胞27.25±2.06個明顯減少（P<0.01）。8、MKN28-siRNA2和S

11、GC7901-siRNA2細胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤的平均體積分別顯著小于MKN28-pSilencer和SGC7901-pSilencer細胞形成腫瘤的平均體積（P均<0.05）。9、CyclinD1在URG4過表達的GES-pcDNA3-URG4細胞中表達高于對照GES-pcDNA3細胞；而通過URG4-siRNAs下調(diào)MKN28和SGC7901細胞中URG4表達后，CyclinD1表達亦被下調(diào)，以URG4-siRNA2效果最為明顯。1

12、0、URG4基因能夠促進NIH3T3細胞生長和加快細胞周期，但不能使轉(zhuǎn)染后的NIH3T3細胞在軟瓊脂內(nèi)或裸鼠體內(nèi)成瘤。
　　[結(jié)論]
　　1、URG4在胃癌組織和對應癌旁組織中表達存在顯著差異，提示URG4可能參與了胃癌的發(fā)生。2、URG4通過促進胃癌細胞生長、細胞周期、增強胃癌細胞成瘤能力等生物學特性促進胃癌的發(fā)生發(fā)展，具有癌基因樣作用。3、URG4可能主要通過調(diào)節(jié)CyclinD1的表達來發(fā)揮作用。4、URG4基因能夠使N