GALNT7參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究.pdf

1、【目的】鼻咽癌在中國南方發(fā)病率極高，尤其是廣東省，發(fā)病率較歐美等其他地區(qū)高25至30倍。鼻咽癌發(fā)生部位的隱匿性和早期臨床表現(xiàn)的不明顯性使得其早期診斷相對(duì)困難。而且，鼻咽癌具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者愈后較差。目前作為鼻咽癌主要治療手段的放療亦面臨著腫瘤的輻射抗性和組織的嚴(yán)重?fù)p傷性兩大難以解決的問題。所以，探討鼻咽癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制至關(guān)重要。早日找到鼻咽癌特異性的標(biāo)志物來指導(dǎo)臨床進(jìn)行早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估，也必將帶

2、來重大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。GALNT7是多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase, ppGalNAc-T)家族中的成員,是催化O-聚糖合成第一步的酶,O-糖基化與細(xì)胞識(shí)別、腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和粘附等功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作利用QPCR的技術(shù)驗(yàn)證了GALNT7在鼻咽癌組織和細(xì)胞中是低表達(dá)的，且其表達(dá)與miR-494的表達(dá)是負(fù)相關(guān)的。在此，我們旨在以鼻

3、咽癌為研究對(duì)象，采用RNAi沉默GALNT7的方法研究GALNT7在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的生理功能，為鼻咽癌早期診斷、治療，研制新的基因靶向藥物提供重要的實(shí)驗(yàn)線索和依據(jù)。
　　【方法】我們用qRT-PCR檢測(cè)miR-494和GALNT7在30例鼻咽癌組織和20例鼻咽正常組織的表達(dá)量，雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)用來驗(yàn)證GALNT7為miR-494的作用靶點(diǎn)，并且用qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)分別在mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證

4、了GALNT7為miR-494的作用靶點(diǎn)。MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)GALNT7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響；Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)用來驗(yàn)證GALNT7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響；光天蛋白酶3-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定及Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GALNT7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的的影響；最后用病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞后注射到裸鼠皮下成瘤，觀察miR-494及GALNT7對(duì)動(dòng)物水平瘤體生長的影響。
　　【結(jié)果】MiR-494表達(dá)量在鼻咽

5、癌組織較正常鼻咽組織下調(diào)，GALNT7的表達(dá)水平與miR-494的表達(dá)水平在鼻咽癌細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體后與miR-494 mimic共轉(zhuǎn)染，與對(duì)照組相比，鼻咽癌細(xì)胞6-10B、9-4E和CNE2細(xì)胞中熒光素酶的活性被敲低(GALNT7，p=0.030，p<0.001，p=0.026)；共轉(zhuǎn)染miR-494 inhibitor，鼻咽癌細(xì)胞中GALNT7活性無明顯改變；構(gòu)建的相應(yīng)的突變體后再與miR-494 mimic、mi

6、R-494 inhibitor分別共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)其活性與對(duì)照組相比也未見明顯差異。QRT-PCR顯示miR-494過表達(dá)后GALNT7在mRNA水平下降。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-494 mimic明顯下調(diào)GALNT7的蛋白水平表達(dá)， miR-494 inhibitor對(duì)GALNT7蛋白水平表達(dá)的影響未見明顯差異。
　　MTT檢測(cè)顯示與對(duì)照組相比，GALNT7-siRNA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞 CNE2、6-10B和9-4E在2

7、4h，48h和72h時(shí)的增殖抑制率分別為23.37％(24 h),17.76%(48 h),和24.86%(72 h)(p=0.015);14.28%(24 h),22.77%(48 h),和1.44%(72 h)(p=0.002);21.38%(24 h),20.58%(48 h),和41.84%(72 h)(p=0.003)。克隆形成實(shí)驗(yàn)中，GALNT7-siRNA使得和CNE2、6-10B和9-4E三株鼻咽癌細(xì)胞克隆云集塊少且小，

8、抑制率分別為75.4%,61.7%,46.9%（p<0.05）
　　Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，GALNT7-siRNA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2、6-10B和9-4E在48h后遷移抑制率分別為52.57%(p=0.008),46.95%(p=0.017),和62.5%(p=0.003)。劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí) GALNT7-siRNA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞 CNE2、6-10B和9-4E在48h后遷移抑制率分別為41.45%(p=0.029),59.

9、34%(p=0.002),和66.66%(p=0.013)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了 GALNT7-siRNA的鼻咽癌細(xì)胞CNE2、6-10B和9-4E中細(xì)胞侵襲的數(shù)量分別減少37.85%(p=0.032),47.48%(p=0.049),和51.91%(p<0.001)。
　　光天蛋白酶3-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染GALNT7-siRNA的鼻咽癌細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的光天蛋白酶3活性相比明顯升高（cne

10、2,9-4e,6-10b,p<0.05）。Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)同樣也顯示相同結(jié)果，轉(zhuǎn)染GALNT7-siRNA的鼻咽癌細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比在鏡下被染色的凋亡細(xì)胞明顯增多（p<0.05）。
　　裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染GALNT7-siRNA的鼻咽癌細(xì)胞所成瘤體較轉(zhuǎn)染無意鏈鼻咽癌細(xì)胞所成的瘤體更小，重量較輕。GALNT7-siRNA組及miR-494 MIMIC組較各自對(duì)照組顯著抑制腫瘤的生長，GALNT7-siRNA組

11、最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為（809.56±179.53 mm3,749.77±143.1 mm3,518.88±85.52 mm3。siRNA對(duì)照組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為（1165.86±340.55 mm3,966.47±226.78 mm3,680.01±138.86 mm3），較對(duì)照組明顯減小(p=0.008, p=0.048, and p=0.035)。miR-494 MIMI

12、C組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為652.32±119.82 mm3,608.32±121.84mm3、530.54±104.28 mm3, MIMIC對(duì)照組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為887.27±270.4 mm3,861.91±186.33 mm3,666.59±95.44 mm3，較對(duì)照組明顯減小(p=0.048,p=0.004,p=0.018)，同樣這兩組的最終瘤體重量也較各自對(duì)照組為

13、輕（p<0.05）。然而轉(zhuǎn)染了miR-494 inhibitor的鼻咽癌細(xì)胞較其對(duì)照組的成瘤作用卻更加明顯，miR-494 inhibitor組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為1098.27±427.75 mm3,726.44±187.97 mm3,717.4±149.43 mm3, inhibitor對(duì)照組最終瘤體大小在CNE2、9-4E、6-10B分別為834.36±413.28 mm3,542.03±166.43

14、 mm3,549.4±98.03 mm3，miR-494 inhibitor組較其對(duì)照組所成腫瘤明顯更大(p=0.177, p=0.038, and p=0.019),同樣miR-494 inhibitor組的最終瘤體重量也較其對(duì)照組更重（p<0.05）。
　　【結(jié)論】GALNT7的表達(dá)量在鼻咽癌組織較鼻咽正常組織上調(diào)，MiR-494表達(dá)量在鼻咽癌組織較正常鼻咽組織下調(diào)，GALNT7的表達(dá)水平與miR-494的表達(dá)水平在鼻咽癌細(xì)胞