XBP1 mRNA參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 緩和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的非折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse，UPR)對于真核生物細(xì)胞的存活是至關(guān)重要的。作為UPR一個主要的下游通路，X盒結(jié)合蛋白1(X-boxbindingprotein1，XBP1)可以觸發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而它的表達(dá)是受一種非常規(guī)的剪接機(jī)制所調(diào)控的，即在特異性核酸內(nèi)切酶IRE-1和一種未知的RNA連接酶共同作用下移除XBP1umRNA分子內(nèi)一個26nt（n

2、ucleotide）的內(nèi)含子。與已知的發(fā)生于細(xì)胞核中的常規(guī)剪接不同，對于這種非常規(guī)剪接的亞細(xì)胞定位仍存在很大爭議。而且已知XBP1s與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如肝癌、多發(fā)性骨髓瘤及乳腺癌等，那么腫瘤細(xì)胞中XBP1mRNA的剪接及XBP1s轉(zhuǎn)錄因子的生成是否存在獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的其他通路也是未知。
　　 本課題擬以乳腺癌細(xì)胞系為模型，研究乳腺癌細(xì)胞中的XBP1mRNA剪接的亞細(xì)胞定位，同時明確乳腺癌細(xì)胞中是否存在獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的

3、XBP1mRNA的非常規(guī)剪接機(jī)制及這一非常規(guī)剪接與乳腺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。以期為乳腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.通過RT-PCR技術(shù)檢測乳腺癌細(xì)胞中XBP1mRNA的表達(dá)水平及其剪接情況。
　　 2.構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激熒光蛋白指示器模型ERAI(ERstressactivatedindicator,ERAI)，轉(zhuǎn)導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞篩選出理想的細(xì)胞模型MCF-7/ERAIm454-557用于研究乳

4、腺癌細(xì)胞中XBP1mRNA的非常規(guī)剪接。
　　 3.通過DTT誘導(dǎo)試驗(yàn)及洗滌試驗(yàn)評估ERAIm454-557mRNA及XBP1mRNA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感性差異。
　　 4.通過RT-PCR評價IRE1α降表達(dá)對XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA非常規(guī)剪接的影響。通過免疫熒光試驗(yàn)檢測在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下乳腺癌細(xì)胞中IRE1α的定位。
　　 5.通過核質(zhì)分離RT-PCR比較細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中XBP1mRN

5、A及ERAIm454-557mRNA的剪接差異，明確mRNA剪接的亞細(xì)胞定位。
　　 6.利用放線菌素D(ActD)抑制MCF-7/ERAIm454-557模型細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后，再行核質(zhì)分離RT-PCR評價ActD對XBP1mRNA及ERAIm454-557mRNA的剪接影響;另外以20mMDTT誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞并隨時間梯度收集總RNA行RT-PCR檢測XBP1mRNA的剪接情況。從而分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性XBP1mR

6、NA剪接的相關(guān)性。
　　 7.構(gòu)建XBP1u與mCHerry熒光蛋白融合的片段缺失亞型，轉(zhuǎn)導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞，觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度及熒光定位，并通過RT-PCR觀察不同亞型之間XBP1mRNA的剪接差異。
　　 8.構(gòu)建僅含有XBP1mRNA中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的ERAIm485-530模型，并轉(zhuǎn)導(dǎo)入MCF-7細(xì)胞中觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度，評價應(yīng)激敏感序列對XBP1mRNA非常規(guī)剪接的影響。
　　 9.DTT誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞后提取

7、細(xì)胞質(zhì)總RNA，平均分為四份分別靜置0min、10min、20min、40min，然后通過RT-PCR檢測XBP1umRNA及XBP1smRNA的水平，評估兩者穩(wěn)定性差異。
　　 10.將XBP1過表達(dá)及降表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入MCF-7/ERAI454-557模型細(xì)胞，RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測XBP1及ERAImRNA表達(dá)量的變化及其剪接差異。
　　 11.采用細(xì)胞計數(shù)法及SoftAga實(shí)驗(yàn)分別檢測XBP1s降表達(dá)及過表達(dá)對乳

8、腺癌細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.在無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的條件下，乳腺癌細(xì)胞中存在XBP1smRNA，且水平高于正常乳腺上皮細(xì)胞。
　　 2.篩選出了理想的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指示器模型ERAIm454-557，并經(jīng)測序證實(shí)ERAIm454-557mRNA的剪接與XBP1mRNA的剪接方式相統(tǒng)一。
　　 3.DTT誘導(dǎo)試驗(yàn)及洗滌試驗(yàn)證實(shí)ERAIm454-557mRNA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低

9、于內(nèi)源性的XBP1mRNA。
　　 4.RT-PCR結(jié)果顯示IRE1α降表達(dá)質(zhì)?？梢悦黠@的抑制ERAIm454-557mRNA的剪接;IRE1α免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)DTT誘導(dǎo)組非常明顯的出現(xiàn)IRE1α的細(xì)胞核定位，這表明在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，IRE1α可以易位到細(xì)胞核。
　　 5.核質(zhì)分離RT-PCR結(jié)果顯示:在沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的前提下，且細(xì)胞核中剪接后的ERAIm454-557mRNA的相對水平與細(xì)胞質(zhì)中的無明顯差異。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

10、應(yīng)激的條件下，細(xì)胞質(zhì)中剪接后的ERAIm454-557mRNA及XBP1mRNA均明顯增加，而細(xì)胞核中并無明顯增加。
　　 6.ActD抑制試驗(yàn)結(jié)果表明在正常條件下，ActD并不能誘導(dǎo)明顯XBP1mRNA的剪接，但是它可以增加細(xì)胞核中剪接后的ERAIm454-557mRNA的比率。但是在0.5mMDTT誘導(dǎo)條件下，ActD可以明顯增加XBP1smRNA及剪接后的ERAIm454-557mRNA的比率。在高濃度DTT誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

11、激前提下，隨著誘導(dǎo)時間的延長，細(xì)胞質(zhì)中剪接后的XBP1mRNA明顯增加，而細(xì)胞核中剪接后的XBP1mRNA則只是在逐步緩慢的增加。這一結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可以促進(jìn)細(xì)胞核中XBP1mRNA的非常規(guī)剪接。
　　 7.5'端缺失的XBP1mRNA亞型可以明顯的增加非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性的XBP1mRNA的剪接，由此推論XBP1mRNA的結(jié)構(gòu)變化可能會影響非常規(guī)剪接的定位。
　　 8.MCF-7/ERAIm485-530細(xì)胞可檢測到

12、微弱的細(xì)胞熒光，RT-PCR結(jié)果也顯示在無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下ERAIm485-530mRNA存在少許的剪接，且DTT誘導(dǎo)對ERAIm485-530mRNA的剪接并無影響;MCF-7/ERAIm485-530細(xì)胞核質(zhì)分離RT-PCR結(jié)果則顯示ERAIm485-530mRNA的非常規(guī)剪接發(fā)生于細(xì)胞核中。
　　 9.細(xì)胞質(zhì)總RNA按時間梯度靜置后行RT-PCR結(jié)果顯示，隨時間延長XBP1smRNA出現(xiàn)明顯降解，而XBP1umRNA降解不

13、明顯，說明XBP1umRNA的穩(wěn)定性優(yōu)于XBP1smRNA。
　　 10.無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，XBP1降表達(dá)并不能明顯的降低XBP1mRNA的水平;而在DTT誘導(dǎo)下，XBP1降表達(dá)不僅明顯降低了XBP1smRNA的水平，還增加了XBP1umRNA的水平。同時，在無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，XBP1降表達(dá)明顯降低了剪接后的ERAIm454-557的水平;而在DTT誘導(dǎo)下，XBP1降表達(dá)也可以明顯抑制ERAIm454-557剪接。
　

14、　 11.細(xì)胞計數(shù)及SoftAga試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)XBP1s過表達(dá)后MCF-7細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力均增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.乳腺癌細(xì)胞中存在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性的XBP1mRNA的剪接，且XBP1mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩端的應(yīng)激敏感序列是XBP1mRNA非常規(guī)剪接的關(guān)鍵。
　　 2.非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴的XBP1mRNA的剪接發(fā)生于細(xì)胞核中并需要IRE1α的參與。
　　 3.MCF-7細(xì)胞中XBP1s的存