長鏈非編碼RNA MALAT1在骨肉瘤臨床預(yù)后中的作用分析及相關(guān)調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　分別檢測骨肉瘤組織與臨近非腫瘤組織，骨肉瘤患者血清和健康體檢人群血清長鏈非編碼RNA MALAT的表達(dá)水平，并對其表達(dá)水平和骨肉瘤患者的臨床特征之間的關(guān)系，在診斷，預(yù)后中的價(jià)值進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上，文章進(jìn)一步檢測了MALAT1在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并分析MALAT1在骨肉瘤細(xì)胞增殖，凋亡和遷移，侵襲中的作用及對鈣黏蛋白和miR-205的調(diào)控，從而揭示MALAT1在骨肉瘤疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：

2、r>　　1.共收集66例骨肉瘤組織及臨近非腫瘤骨組織，45例骨肉瘤患者血清及30例正常體檢人群的血清樣本。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測MALAT1及其他相關(guān)分子的表達(dá)水平。
　　2.通過繪制ROC曲線及術(shù)后跟蹤調(diào)查來對MALAT1在骨肉瘤患者中的診斷和預(yù)后價(jià)值進(jìn)行分析。
　　3.共使用U2OS，MG63，SAOS-2和SOSP-9607四種骨肉瘤細(xì)胞系，和一種正常成骨細(xì)胞系hFOB作為對照。運(yùn)RT-qPC

3、R方法檢測上述細(xì)胞MALAT1及其他相關(guān)分子的表達(dá)水平。
　　4.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法對上述細(xì)胞系進(jìn)行MALAT1及其他相關(guān)分子高表達(dá)和沉默處理，處理之后進(jìn)行后續(xù)的功能試驗(yàn)或RNA和蛋白水平檢測。
　　5.通過CCK8方法對骨肉瘤細(xì)胞系的增殖能力進(jìn)行評估，通過流式凋亡細(xì)胞術(shù)對骨肉瘤細(xì)胞系的凋亡情況進(jìn)行評估，通過運(yùn)用transwell小室實(shí)驗(yàn)對骨肉瘤細(xì)胞系的遷移侵襲能力進(jìn)行檢測;運(yùn)用RNA免疫共沉淀(RIP)和DNA免疫共沉淀

4、(ChIP)方法對MALAT1與EZH2，EZH2與鈣黏蛋白之間的交聯(lián)進(jìn)行分析;運(yùn)用westemblot方法或免疫熒光方法對本研究中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.四種骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，MG63，SAOS-2和SOSP-9607的MALAT1表達(dá)水平顯著高于正常成骨細(xì)胞系hFOB的表達(dá)水平;66例骨肉瘤患者腫瘤組織的MALAT1表達(dá)水平顯著高于相鄰正常骨組織表達(dá)水平，而且58.8％的患者的MALAT1表達(dá)水

5、平高于相鄰正常骨組織的表達(dá)的兩倍水平。臨床特征分析發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織的MALAT1表達(dá)水平與患者腫瘤侵襲(T)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)顯著相關(guān)。三期和四期的骨肉瘤患者的表達(dá)水平顯著高于一期和二期患者。高表達(dá)MALAT1的臨床骨肉瘤患者其總體生存時(shí)間和無病生存時(shí)間顯著短于低表達(dá)的患者。
　　2.RT-qPCR發(fā)現(xiàn)MALAT1和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平在骨肉瘤組織中呈顯著負(fù)相關(guān)。Transwelll小室實(shí)驗(yàn)提示MA

6、LAT1能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并且能夠顯著降低E-cadherin蛋白的表達(dá)水平并促進(jìn)Vimentin蛋白的表達(dá)。CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　3.RT-qPCR結(jié)果證明EZH2 mRNA表達(dá)水平在骨肉瘤組織中顯著升高，在骨肉瘤細(xì)胞系中也顯著升高，并且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MALAT1和EZH2表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EZH2中MALAT1富集顯著，進(jìn)一步分段RT-qPC

7、R發(fā)現(xiàn)MALAT1的3'端與EZH2相交聯(lián)。
　　4.EZH2能夠負(fù)向調(diào)控E-cadhein的表達(dá)，并且染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)證實(shí)E-cadherin與EZH2相交聯(lián)，從而抑制E-cadherin的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MALAT1下調(diào)能夠顯著降低E-cadherin與EZH2的交聯(lián)作用，從而說明MALAT1通過與EZH2相結(jié)合作用的方式抑制E-cadherin的表達(dá)。并且功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)si-EZH2沉默EZH2之后能夠顯著

8、逆轉(zhuǎn)MALAT1對細(xì)胞遷移侵襲能力及EMT能力的影響。
　　5.通過miRcode生物信息學(xué)分析，證明了MALAT1與miR-205有結(jié)合區(qū)域，而且MALAT1和miR-205能夠相互抑制對方的表達(dá)水平，而且功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-205能夠顯著抑制MALAT1引起的細(xì)胞增殖能力的提高。從而揭示了MALAT1對細(xì)胞增殖能力影響是通過miR-205起作用。
　　結(jié)論：
　　MALAT1在骨肉瘤組織中高表達(dá)并且腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

9、，高表達(dá)MALAT1的患者其生存能力顯著降低，說明MALAT1可作為骨肉瘤患者臨床預(yù)后的重要因子。相關(guān)功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠顯著提高骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖，這是通過與EZH2相關(guān)聯(lián)從而進(jìn)一步降低E-cadherin的表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。最后，還發(fā)現(xiàn)MALAT1與miR-205相互抑制，miR-205能夠顯著逆轉(zhuǎn)MALAT1所導(dǎo)致的升高的增殖能力?？傊恼陆沂玖薓ALAT1作為一個(gè)長鏈非編碼RNA在骨肉