無血清培養(yǎng)DCs激活的CIK治療肝癌的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：1.建立一套高效的無血清體外制備DCs疫苗的方法，為DCs疫苗的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.探討DCs對(duì)CIK增殖和殺傷肝癌細(xì)胞的影響。 方法：1.采集臍血，分離其中的單個(gè)核細(xì)胞，用無血清DCs培養(yǎng)基(SFM)/含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(SM)，并添加rhGM-CSF、rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化為未成熟DCs，第5天添加肝癌細(xì)胞凍融抗原，TNF-α等促成熟因子，第7天收獲成熟DCs，以倒置顯微鏡觀察D

2、Cs的細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀測(cè)定DCs表面標(biāo)志物的表達(dá)；并從細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物等方面比較用無血清DCs培養(yǎng)基(SFM)/含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(SM)培養(yǎng)的DCs。2.用細(xì)胞因子γ-IFN、IL-2、CD3-Ab、IL-1a誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞為CIK，第7天DCs和CIK共同培養(yǎng)。采用MTT法測(cè)定無血清培養(yǎng)基和含5％胎牛血清的培養(yǎng)基產(chǎn)生的DCs刺激CIK的促增殖效應(yīng)和DC-CIK對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 結(jié)果：1

3、.無論采用無血清樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基(SFM)還是含5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，臍血來源的單核細(xì)胞在細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α的誘導(dǎo)下，并負(fù)載7721肝癌細(xì)胞凍融抗原后，均能分化成為具有典型形態(tài)和表型的成熟DCs，流式結(jié)果顯示：采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的DCs表面標(biāo)志物表達(dá)水平為(％)：CD1a56.6±3.8、CD11c64.5±4.3、CD1419.5±1.8、CD4077.8±7.5、CD8370.8±

4、5.1、CD8676.5±6.3、HIA-DR91.5±3.5；采用5％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的SM-DC表面標(biāo)志物表達(dá)水平為(％)：CD1a59.3±5.1、CD11c59.6±6.2、CD1420.1±2.2、CD4075.6±6.4、CD8365.2±4.4、CD8680，4±6.9、HLA-DR94.5±2.8；兩組DEs的表面標(biāo)志均無差別，(P>0.05)。2.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果：DCs刺激CIK的刺激指數(shù)為

5、：無血清DEs培養(yǎng)基組2.01±0.22，含血清培養(yǎng)基Des組2.31±0.24；統(tǒng)計(jì)分析表明：不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的DCs，在促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用中無差別，均能有效地刺激CIK增殖，(P>0.05)。3.殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果：DCs激活CIK對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷率為(％)：無血清DCs培養(yǎng)基組SFMDC-CIK74.5±7.5，含血清培養(yǎng)基組SMDC-CIK77.9±6.0，單一CIK54.1±4.9，統(tǒng)計(jì)分析表明：①SM-DC和SFM-DC激活的CI

6、K對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷率無明顯差別，(P>0.05)；②SM-DC和SFM-DC激活的CIK對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷率均高于未被DCs激活的CIK，(P<0.05)。 結(jié)論：1.我們初步建立了一套體外無血清制備DCs的方法；無血清樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基在添加細(xì)胞因子rhGM-CSF100ng/ml、rhIL-4、50ng/ml、TNF-α50ng/ml及肝癌抗原后，能夠誘導(dǎo)臍血單個(gè)核細(xì)胞分化為具有典型形態(tài)和高度表達(dá)DEs表面標(biāo)志的成熟樹突狀細(xì)胞。